Galaktosylierung in Pflanzen

Die Mehrheit der Protein-Pharmazeutika benötigt das Anheften von Zuckern (Glykosylierung) um ihre volle Wirksamkeit entfalten zu können. Die derzeitigen auf Säuger-Zellkulturen basierenden Herstellungsverfahren erlauben keine Kontrolle über die Glykosylierung, es entsteht eine Mischung von Glykoformen die für manche Proteine gut geeignet sind, bei manchen die Aktivität reduzieren oder sogar ganz auslöschen können. Dieser Projektantrag hat das Ziel ein Pflanzenexpressionssystem zu generieren, das die Produktion von Glykoproteinen mit homogenen beta 1,4 galaktosylierten Zuckerstrukturen erlaubt. Diese Säuger spezifische Glykosylierung, die normalerweise in Pflanzen nicht vorkommt, kann einerseits die Effizienz eines Protein-Produktes deutlich erhöhen andererseits dient es als Voraussetzung für eine effiziente Sialylierung, eine weitere wichtige Säuger spezifische Glykosylierung. Kürzlich gelang es uns, durch gezieltes "Glyko-engineering" eine Pflanzen Mutante (dXT/FT) herzustellen die keine pflanzenspezifische Zuckerreste mehr hat, indes aber eine Säuger-ähnliche Zucker Struktur, die Voraussetzung für eine effiziente Galaktosylierung, synthetisiert. Mittels transienter Expression des humanen Enzymes beta 1,4 Galaktosyltransferase (GalT) in dXT/FT konnten wir eine Galaktosylierung eines humanen Reporter Glykoproteines von über 80% erreichen. Auf diesen Daten basierend, soll nun in diesem Projektantrag eine stabile Linie entwickelt werden, die eine effiziente Galaktosylierung erlaubt. Ein hoch galaktosylierter therapeutisch relevanter monoklonaler Antikörper soll am Ende in dieser Mutante exprimiert und in Hinsicht auf seine Funktionalität getestet werden. Die Verfügbarkeit von Pflanzenmutanten die die Herstellung von rekombinanten Glykoprotienen mit einer konsistenten beta 1,4 Galaktosylierung erlauben, dient als Ersatz von teuren Säugetierzellkulturen. Weiters erlaubt eine homogene Galaktosylierung eine bessere Aufklärung der Funktion dieses Zuckerrestes und ist ein weiterer Meilenstein in Hinblick auf die Rekonstruktion von humaner Protein-Sialylierung in Pflanzen.

Der größte Erfolg dieses Projektes liegt wohl darin, dass es gelungen ist ein auf Pflanzen basierendes Produktionssystem für pharmazeutisch relevante Proteine zu etablieren dessen Produkte dem menschlichen Gegenstück möglichst ident sind. Das Hauptaugenmerk lag darin die pflanzliche Zelle so zu verändern, dass sie eine für viele Proteine wichtige Modifizierung, nämlich das Anheften von Zuckerresten (Glykosylierung), so ausführt, wie sie in menschlichen Zellen passiert. Dies ist eine der großen Herausforderungen der biopharmazeutischen Industrie. In einer Serie von Experimenten konnten wir die vollständige Humanisierung des Zuckerbiosyntheseweges in pflanzlichen Zellen erwirken was dazu führte, dass Proteine mit human identen Glykosylierungsmustern erzeugt wurden. Mehrere funktionelle Studien zeigten, dass solche Proteine hochwirksam sind und daher als neue Klasse von pharmazeutischen Produkten gehandelt werden. Die während des FWF Projektes erzielten Ergebnisse waren wichtige Bausteine zu einem kürzlich initiierten größeren Konsortialprojekt der Projektleiterin mit Firmenbeteiligung (Laura Bassi Center of Expertise). Ein weiterer wichtiger Meilenstein des vorliegenden FWF Projektes war die Aufklärung von intrazellulären Transportmechanismen in Pflanzen. Dazu eignen sich Glykosylierungs- enzyme besonders gut, da sie in verschiedenen zellulären Subkompartmenten sitzen. Im Zuge des FWF Projektes konnten wir weitere Puzzlesteine im Transportmechanismus aufdecken. Die Gene von verschiedenen Glykosylierungsenzymen bzw. deren Transportmotive wurden mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen fusioniert und mithilfe einer speziellen Mikroskopiertechnik sichtbar gemacht (konfokale Mikroskopie). Wir konnten zeigen, dass für den Transport nur ganz spezielle kurze Abschnitte die sich an einem Ende der Enzyme befinden für die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen verantwortlich sind. Die Ergebnisse wurden in hochrangigen wissenschaftlichen Journalen publiziert.