Zielgene von beta-catenin während der Skelettentwicklung

Wirbeltiere unterscheiden sich von anderen Lebewesen vorallem dadurch, daß sie ein Endoskelett besitzen. Dieses Endoskelett wird während der Embryonalentwicklung angelegt und entwickelt sich aus mesenchymalen Vorläuferzellen, die sich an ganz spezifischen Stellen in Knorpelzellen, knochenbildende Zellen und Zellen der Gelenke differenzieren. Während der letzten Jahre konnten ein Anzahl von Trankriptionsfaktoren identifiziert werden, welche unbedingt für die Differenzierung von Knorpelzellen bzw. von knochenbildenden Zellen aus mesenchymalen Vorläuferzellen benötigt werden. Wesentlich weniger weis man über die Signalwege, die diese Differenzierungswege steuern. Unser Labor hat vor kurzem gezeigt, daß der Wnt/ß-catenin Signalübermittlungsweg eine entscheidende Role bei diesem Prozeß spielt. Dieser Signalweg führt im aktiven Zustand zu einer Anreicherung des ß-catenin Proteins im Kern, wo dieses Protein zusammen mit Mitgliedern der TCF/LEF Transkriptions-factor Familie einen aktiven Transkriptionsfactor-Komplex bildet und Zielgene aktiviert. Während der Skelettentwicklung unterdrückt dieser Signalweg, wenn er active ist, zum einen die Differenzierung von mesenchymalen Zellen in Skelett-Vorläuferzellen. D.h. nur mesenchymale Zellen, in welchen die Menge an ß- catenin Protein niedrig ist können in Skelettvorläuferzellen differenzieren. Letztere produzieren wichtige Faktoren für die weitere Skelettentwicklung, wie z.B. die Transkriptionsfaktoren Sox9, Runx2, Sox5 und Sox6, sowie extrazelluläre Proteine wie z.B. Collagen 2a1. Zum anderen, konnten wir zeigen, daß in den Vorläuferzellen von knochenbildenden Zellen und auch Zellen der Gelenkanlagen die Menge an -catenin Protein hochreguliert werden muß, damit das Knorpelzell-Differenzierung Potential dieser Zellen active unterdrückt werden kann und es diesen Zellen somit möglich ist sich in Knochenbildende Zellen bzw. Zellen des Gelenks weiter zu entwickeln. Das Ziel des hier vorgestellten Projekts ist es Gene zu identifizieren, welche von dem ß-catenin-Transkritionsfaktor Komplex reguliert werden. Dazu sollen Expressionprofile und Chrommatinbindungsstudien an Material von Primärzellen, in denen ß-catenin entweder inaktiviert bzw aktiviert wurde, durchgeführt werden. Unsere spezifischen Ziele sind die Identifizierung direkter Zielgene des Wnt/ß-catenin Signalwegs in den verschiedenen Skelettvorläuferzell-Populationen, sowie die anschließende Analyse der Funktion dieser Zielgene. Unsere Motivation für dieses Projekt beruht darauf, daß wir uns erhoffen dadurch neue Erkenntnisse in der Skelettentwicklung zu gewinnen, die in der Zukunft für eine gezielte Differenzierung von Stammzellen in die enstprechenden Skelettvorläuferzellen, wie z.B. Knorpelzellen, knochenbildende Zellen sowie Zellen der Gelenke, hilfreich seien können.

Das Vertebraten-Skelett setzt sich aus über 200 Einzel-Elementen (Knochen) zusammen, die sich in ihrer Form und Grösse unterscheiden. Die Mehrzahl dieser Knochen wird hierbei durch endochondrale Ossifizierung gebildet, wobei zuerst eine Knorpelvorlage gebildet wird, die dem zukünftigen Knochen in Position, Grösse und Form entspricht. Diese wird dann später während der embryonal Entwicklung in Knochen umgewandelt. Dieser Prozess muss auf vielen Ebenen koordiniert werden. Erstens muss sichergestellt sein, dass die Bildung der Knorpelanlagen für die einzelnen Skelettelemente nur an bestimmten Stellen erfolgt. Zweitens stammen die Zellen die das Knorpelskelett bilden (Chondrozyten) und die Zellen, die die Knochenmatrix bilden (Osteoblasten) von einem gemeinsamen Vorläufer ab; d.h. es muss Mechanismen geben, die sicherstellen, das sich die Vorläuferzelle entweder zu einer Chondrozyte oder zu einem Osteoblasten entwickelt. Und zuletzt, muss die weitere Differenzierung der Chondrozyten in der Knorpelanlage mit der der Osteoblasten im umliegenden Gewebe koordiniert werden, zum einen damit sich ein Knochenschaft um die Knorpelanlage ausbilden kann und zum anderen an der Übergangszone vom Knorpel zum trabekulären Knochen. . Unsere vorangegangenen Arbeiten haben gezeigt, dass der Wnt/beta-catenin Signalweg aufgrund seiner anti-chondrogenen Aktivität eine wichtige Rolle während der ersten beiden Schritte erfüllt; hier unterbindet er in mesenchymalen Zellen die Differenzierung in Skelett-vorläufer und unterdrückt das chondrogene Potential von Osteoblasten-Vorläuferzellen. Das vorliegende Projekt hatte zum Ziel beta-catenin regulierte Gene zu identifizieren, die eventuell am anti-chondrogenen Effekt des aktivierten Wnt/beta-catenin Signalweges teil-haben könnten. Hierfür haben wir eine Transkriptom-Analyse an mesenchymalen Zellen der frühen Extremitätenanlage und Knorpelzellen nach Eliminierung bzw. Aktivierung von beta-catenin durchgeführt. Für die weitere Analyse der de-regulierten Gene haben wir uns speziell auf Transkriptionsfaktoren konzentriert, da diese potentiell als Vermittler oder Cofaktoren für die anti-chondrogene Aktivität des aktivierten beta-catenin/Tcf Komplexes fungieren könnten. Hierfür wurde die Deregulierung der potentiellen Kandidatengene in weiteren in vitro und in vitro noch einmal verifiziert. Zudem haben wir die regulatorischen Regionen von bestättigten Kandidatengenen im Hinblick auf eine mögliche direkte Regulierung durch einen beta-catenin/Tcf Komplex mittels Bioinformatik und in vitro Untersuchungen weiter charakterisiert. Der Transkriptionsfaktor Sox9, der als Masterregulator der Knorpelzellentwicklung gilt, war eines der Gene, die in beiden Versuchsreihen nach Aktivierung von beta-catenin reprimiert wurde. Unter den Transkriptionsfaktoren, deren Expression in beiden Versuchsreihen hoch-reguliert war, befand sich Tcf1, welches in einen transkriptionalen Komplex mit beta-catenin eingeht. Dies war vorallem deshalb interesant, da unsere in vitro Promoterstudien daraufhingewiesen haben, dass die Sox9 Expression speziell durch einen beta-catenin/Tcf1 Komplex inhibiert werden kann. Zwei weitere Transkriptionsfaktoren, die ebenfalls positive durch aktiviertes beta- catenin reguliert wurden, waren ebenfalls in der Lage den Sox9-Promoter in vitro negative zu regulieren. Daher sind diese beiden Transkriptionsfaktoren möglicherweise an der anti-chondrogenen Aktivität von beta-catenin beteiligt.