Glykomodifizierte Horseradish Peroxidase für gezielte Krebsbekämpfung

Nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen stellt Krebs momentan die zweithäufigste Todesursache in Europa dar. Im Jahr 2011 sind ~1,3 Millionen Menschen in Europa an Krebs gestorben. Die gebräuchlichsten Therapien im Kampf gegen Krebs sind Chemo- und Strahlentherapien, die stark negative Auswirkungen auf den menschlichen Körper haben und unangenehme und schmerzliche Nebeneffekte verursachen. Eine schonendere und gezieltere Methode Krebszellen zu bekämpfen, wie z.B. eine sogenannte Enzym/Prodrug Therapie, würde gesundes Gewebe bedeutend weniger schädigen und das Leben von Krebspatienten viel erträglicher machen. Das Pflanzenenzym Horseradish Peroxidase (HRP; EC 1.11.1.7) beschreibt ein sehr nützliches Mittel für gezielte Krebstherapien. Das Isoenzym HRP C1A oxidiert das Pflanzenhormon Indol-3-Essigsäure, welches oxidativen zellulären Stress induziert, Apoptosewege aktiviert und dadurch die Lebensfähigkeit von Krebszellen reduziert. Trotz dieser sehr nützlichen Anwendung von HRP, wurde dieses Enzym bis jetzt jedoch, aufgrund der ziemlich umständlichen Produktion und Reinigung aus der Pflanze und aufgrund seines heterogenen Glykosylierungsmusters, in der gezielten Krebsbekämpfung noch nicht vermehrt eingesetzt. Auch eine alternative Herstellung von HRP in Hefe stellt aufgrund der Eigenschaft von Hefe Glykoproteine zu hypermannosylieren ein Problem dar, da diese zusätzlichen Zuckerketten das Downstream Processing erheblich erschweren und Immunantworten im Menschen auslösen. Das Ziel dieser inter- und multidisziplinären Studie ist es, das Glykosylierungsmuster von HRP so zu modifizieren, dass Varianten mit hoher katalytischer Aktivität und Stabilität erhalten werden, die aber gleichzeitig weniger Zucker an ihrer Oberfläche tragen, was ein einfacheres Downstream Processing ermöglicht. Diese Enzymvarianten werden zur Homogenität gereinigt und bezüglich möglicher Anwendungen in medizinischer Diagnostik und gezielter Krebsbekämpfung getestet.

Das Ziel von Projekt P24861-B19 war es, das Pflanzenenzym Meerrettichperoxidase (HRP) zu modifizieren, um Varianten mit hoher katalytischer Aktivität und Stabilität zu erhalten, die weniger Oberflächenzucker tragen, was die Proteinreinigung erleichtert und Anwendungen in der gezielten Krebstherapie möglich machen sollte. Wir nahmen die unterschiedlichen Hürden im Projekt mittels eines integrierten und multidisziplinären Ansatzes in Angriff. Wir können unsere Resultate kurz wie folgt zusammenfassen: einzelne HRP Isoenzyme können in der Hefe P. pastoris effizient produziert und gereinigt werden es ist uns gelungen die heterogenen Oberflächenzucker der rekombinanten HRP mittels Protein- und Stammengineering zu reduzieren obwohl Oberflächenglykosylierung keine Bedingung für Aktivität der HRP ist, verursacht eine Reduktion derselben geringere Aktivität und Stabilität des Enzyms modifizierte HRP Varianten sind katalytisch aktiv und daher potentiell interessant für medizinische Anwendungen In Projekt P24861-B19 haben wir des Weiteren die Hefe P. pastoris als Expressionssystem für Biopharmazeutika beschrieben, das Einfrierverhalten von HRP in wässriger Lösung untersucht, neue NADH:quinone Oxidoreduktasen in Extremophilen, die potentiell den Energiehaushalt in P. pastoris unterstützen können, untersucht, und neue mixed-feed Strategien für P. pastoris Stämme, die mittels Depressions-Promotoren produzieren, entwickelt. Bislang resultierten die Ergebnisse aus P24861-19 in 16 veröffentlichten Publikationen, 8 eingeladenen Vorträgen auf internationalen Kongressenundmehreren Posterpräsentationen. In all diesen Veröffentlichungen wurde der FWF als Partner erwähnt, was Transparenz und Bekanntheit in der Öffentlichkeit förderte. Zwei weitere Publikationen sind in Vorbereitung. Erfolgreiche Kooperationen mit Dr. Lisa Folkes (Gray Institute for Radiation Oncology and Biology at Oxford University, Oxford, UK), Prof. Gabi Dachs (Department of Pathology, University of Otago, Christchurch, New Zealand) und Prof. Anton Glieder (University of Technology Graz, Austria) wurden initiiert und die Studenten, die auf P24861-B19 eingestellt waren (1 PhD und 4 MSc Studenten), konnten die Labore im Ausland besuchen und dort Experimente durchführen. Zusammenfassend kann Projekt P24861-B19 als erfolgreich angesehen werden.