Rolle der Lipidasymmetrie bei der Enzymaktivität von OmpLA

Die räumliche Eingrenzung biochemischer Prozessen war eines der wichtigsten Konzepte für den Ursprung des Lebens, welches von der Natur mittels biologischer Membranen realisiert wurde. Biologische Membranen sind ein komplexes dynamisches Material aus Proteinen, Lipiden und Kohlenwasserstoffen, die für eine Vielzahl von physiologischen Prozessen verantwortlich sind. Um all diese Aufgaben erfüllen zu können, bilden Membranen spezifische molekulare Strukturen aus, deren Zusammensetzung streng kontrolliert wird. Eines dieser spezifischen Merkmale von biologischen Membranen ist eine asymmetrische Verteilung der Lipide in der dem Cytosol oder der extrazellulären Matrix zugewandten Hälfte der Plasmamembran. Von besonderem Interesse sind die Auswirkungen dieser Lipidverteilung auf die Funktion von integralen Membranproteinen, wie etwa der Lipase OmpLA (outer membrane phospholipase A). OmpLA ist ein integrales Membranenzym der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien (z.B. Escherichia coli). In dieser Membran, die durch eine asymmetrische Verteilung von Polysachariden und Phospholipiden charakterisiert ist, liegt OmpLA in einem inaktiven Zustand vor. Wird die Membranstruktur z.B. über Wirkstoffe massiv gestört, so schließen sich einzelne OmpLAs zu Dimeren zusammen und entfernen die Lipide, die über die Störung in die äußere Membranhälfte gelangt sind, über eine Hydrolyse. Die zentrale Hypothese des Projekts ist, dass die asymmetrische Lipidzusammensetzung der äußeren Membran die Dimerisierung des Enzyms verhindert und somit einen intrinsischen biophysikalischen Schalter für die kontrollierte Aktivität des Proteins darstellt, der aktiviert wird wenn die Lipidasymmetrie über eine Störung der Membran zumindest teilweise aufgehoben wird. Für die Studien werden wir OmpLA in verschiedenste künstliche Membranen mit symmetrischer und asymmetrischer Lipidzusammensetzung einbauen und deren Funktion gekoppelt an die jeweilige Membranstruktur untersuchen. Die experimentellen Arbeiten umfassen vor allem eine Kombination von Neutronen und Röntgenstreuexperimenten, mit fluoreszenzbasierten Experimenten. Damit können Effekte der Membranstruktur (z.B. Dicke, Lipidpackungsdichte) auf die Aggregation und Aktivität der Proteine in verschiedenen Membranen untersucht werden. Besonders hervorzuheben ist, dass die Arbeiten an chemisch definierten Systemen durchgeführt werden, d.h. anders als bei biologischen Zellen, sind die Art und Konzentration der Lipide und Proteine fixiert. Das ermöglicht eine stringente experimentelle Kontrolle, die für die Machbarkeit der Untersuchungen unumgänglich ist. Das Projekt ist in ein internationales Netzwerk aus Kooperationspartnern eingebettet. Wir erwarten wesentliche Aufschlüsse zur funktionalen Rolle von Lipidasymmetrie, die auch auf andere Membranproteine anwendbar sind. Somit werden die Resultate eine Grundlage für viele weitere Folgeprojekte auf internationaler Ebene sein. Für die angewandte Forschung könnten die entwickelten Lipid/Protein Modelsystemen auch für ein Screening von membranaktiven antimikrobiellen Wirkstoffen von hohem Nutzen sein.

Alle Plasmamembranen, das sind die äußere Hüllen von Zellen, besitzen ein hohes Maß an Asymmetrie. Das betrifft die Ausrichtung der Membranproteine, z.B. für den gerichteten Transport von Molekülen durch die Membrane, als auch die Verteilung der Membranlipide, d.h. die Zusammensetzung der äußeren Membranhälfte unterscheidet sich massiv von der der inneren Membranhälfte. Ziel des Forschungsprojektes war fundamentale Beweise für eine Verknüpfung dieser Membranasymmetrie mit der Funktion integraler Membranproteine zu liefern. Hierzu wurde die "Outer Membrane Phospholipase A" (OmpLA), ein strukturell und funktionell gut charakterisiertes integrales Enzym, ausgewählt. Aufgabe dieses Proteins ist der Abbau von Phospholipiden (Hydrolyse), wenn sie auf die 'falsche' Seite der Membran kommen. Ziel des Projektes war herauszufinden, ob sich dieser Prozess über eine Änderung der Membranasymmetrie beeinflussen lässt. Zu diesem Zweck wurde OmpLA in Lipidvesikel mit kontrollierter symmetrischer oder asymmetrischer Lipidzusammensetzung rekonstituiert. Funktionsmessungen zeigten, dass OmpLA auf die differentiellen lateralen Druckfelder in asymmetrischen Membranen reagiert. Zwei Hauptergebnisse sind hervorzuheben: (i) Die Aktivität des Proteins wird durch eine zunehmende asymmetrische Zusammensetzung der Membranhälften in neutral geladenen Membranen verlangsamt. Dies kann durch ein einfaches membranvermitteltes allosterisches Modell erklärt werden, dass davon ausgeht, dass OmpLA gegen den außen anliegenden lateralen Membrandruck Arbeit verrichten muss, um die Phospholipide abzubauen. (ii) In negativ geladenen Membranen wurde eine erhöhte Gesamtaktivität des Proteins festgestellt. Interessanterweise lässt sich das zumindest teilweise mit einer Kopplung der Ionen an die gespeicherte spontane Krümmung der Lipide verstehen. Letzteres Ergebnis ergibt ein völlig neues Bild auf die Funktion von Plasmamembran und ihre Kopplung an die Elektrolytzusammensetzung ihrer wässriger Umgebung. Die generische Natur unserer Ergebnisse legt nahe, dass ähnliche membranvermittelte Mechanismen wahrscheinlich auch für andere Membranproteine wirksam sind. Das Verständnis der Kopplung zwischen Membranprotein-Funktion und Membranasymmetrie steckt allerdings noch in den Kinderschuhen. Die Einblicke, die in dieser Arbeit gewonnen wurden, können als einer von vielen Schritten betrachtet werden, die in Richtung eines besseren Verständnisses der Membranfunktion unternommen werden müssen. Die Tatsache, dass die Funktion von Membranproteinen stark von ihrer Membranumgebung beeinflusst wird und asymmetrische Membranen sich sehr unterschiedlich von symmetrischen verhalten, bedingt aber ein ungemein hohes Potential für zukünftige Studien mit zusätzlichen biochemischen Ansätzen. Darüber hinaus zielen die meisten medizinischen Wirkstoffe auf Membranproteine ab, was eine weitere Verbindung zu den pharmazeutischen Wissenschaften darstellt. Es wird erwartet, dass sich durch die Ausweitung solcher Bemühungen ein Paradigmenwechsel in den Lipid-Protein-Interaktionen und der Funktion der Plasmamembran ergibt.