B-Ring Hydroxylierung in der Flavonoidbiosynthese

Das Projekt B-Ring Hydroxylierung in der Flavonoidbiosynthese beschäftigt sich mit wichtigen Enzymen in der Biosynthese von Flavonoiden und anthochloren Pigmenten (Chalcone und Aurone), die für die rote, blaue und gelbe Blütenfärbung und für die Ausprägung von Blütenmalen in Korbblütler-Arten verantwortlich sind und auch gesundheitsfördernde Wirkungen beim Menschen aufweisen. Die Chalcone sind auch die unmittelbaren Vorstufen für die Bildung der Flavonoide, die wichtige Bestandteile der menschlichen Nahrung sind. Aber auch einige pflanzliche Abwehrstoffe auf Isoflavonoidbasis werden ausgehend von den Chalconen gebildet. Bei dem Projekt handelt es sich um ein Folgeprojekt für das auslaufende P29552- B29-Projekt, das mit der Aufklärung der ersten Kristallstruktur eines Cytochrom- P450-abhängigen Enzyms des Flavonoidbiosynthesewegs begonnen hat, wobei die Chalcon3-Hydroxylase (CH3H)als Modellenzymverwendetwird. Die Weiterfinanzierung der Arbeiten ist von entscheidender Bedeutung, damit das Team die Ergebnisse des vorherigen Projekts voll nutzen kann. Die CH3H katalysiert die Einführung einer Hydroxylgruppe an der Position 3 von Chalconen. Die Reaktion weist große Ähnlichkeit mit der Hydroxylierung von Flavonoiden an der Position 3 auf, kann jedoch von der bekannten Flavonoid 3- hydroxylase (F3H) trotz ihrer breiten Substratspezifität nicht katalysiert werden. Die F3`5`H katalysiert hingegen die Einführung von zwei Hydroxylgruppen in den Positionen 3 `und 5`, wodurch die Farbe der resultierenden Pigmente von rot nach blau und violett verschoben wird. Die aufgeklärte dreidimensionale Struktur von CH3H ist wesentlich, um die strukturellen Unterschiede, die die divergente Funktionalität von CH3H und F3`H und den Reaktionsmechanismus von F3`5`H bestimmen, vollständig zu verstehen. In dem Vorgängerprojekt wurden erfolgreich Methoden für die Produktion und Reinigung ausreichender CH3H-Mengen für Kristallisationsexperimente erarbeitet. Die Verfügbarkeit einer ersten Kristallstruktur eines Cytochrom P450 abhängigen Enzyms der Flavonoidbiosynthese wird zu einem ein besseren Verständnis der Funktion der CH3H und weiterer nahe verwandter Enzyme dieses wichtigen Biosynthesewegs führen. Mit diesem Wissen können in Zukunft widerstandsfähigere, attraktivere und gesundheitsförderndere Pflanzen gezüchtet werden.

Das Projekt "B-Ring-Hydroxylation in the flavonoid pathway" ist ein Nachfolgeantrag zu P29552-B29 das sich mit der Etablierung der ersten Kristallstruktur einer Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenase (CYP) des Flavonoidbiosynthesewegs beschäftigt, wobei das CYP75B Enzym Chalkon-3-Hydroxylase (CH3H) als Modell verwendet. CH3H ist eng verwandt mit der gut untersuchten Flavonoid 3'-Hydroxylase (F3'H) und ein Schlüsselenzym bei der Biosynthese von Anthochloren Pigmenten, die bei einer Reihe von Zierpflanzen für gelbe Blütenfarbe sorgen, bei bestimmten Asteraceae-Arten UV-Blütenmale bilden und auch beim Menschen gesundheitsfördernde Wirkungen aufweisen. Ziel des Projekts war es das Verständnis für die Struktur-Funktions-Beziehung in Bezug auf B-Ring-Hydroxylierungsmuster von Flavonoidstrukturen der CYPs zu verbessern Die Identifizierung der Aminosäuren, die an der Substratbindung beteiligt sind, und deren Wirkungsweise ist von zentralem Interesse, da dies eine gezielte Anwendung in der Biotransformation und Züchtung von Pflanzen mit erhöhter Krankheitstoleranz und/oder verbesserten ästhetischen Eigenschaften ermöglicht. Es wurden Verfahren für die rekombinante Herstellung einer löslichen Variante von CH3H und drei Cytochrom P450-Reduktasen aus verschiedenen Zierpflanzen mit hohen Ausbeuten etabliert, die eine Charakterisierung des gereinigten Enzyms ermöglichten und neue Einblicke in die CH3H-Substratspezifität lieferten. Die eingeschränkte Langzeitstabilität von CH3H behinderte jedoch bisher die Kristallisation des Enzyms. Die Studien an F3'H von Malus sp. konzentrierten sich auf den möglichen Beitrag zur Dihydrochalcon-Hydroxylierung und deren Einfluss auf die Glasigkeit beim Apfel, die eine wirtschaftliche bedeutende innere physiologische Störung ist. Die Ergebnisse leisteten auch einen Beitrag bei der erstmaligen Anwendung der Genschere beim Weihnachtsstern, die zur Ausprägung von oranger Blütenfarbe führte. Bei der F3'5'H wurden zum ersten Mal Aminosäuren identifiziert, die für die Enzymaktivität essentiell sind. An dem Projekt beteiligte Personen waren Associate Prof. Heidi Halbwirth (Flavonoid-Biosynthese und hydroxylierenden Enzymen), Univ. Prof. Oliver Spadiut (Proteinproduktion und -reinigung) und Dr. Christian Molitor (Kristallisation und Modellierung) beteiligt. Dieses Projekt führte zu sieben Publikationen in hochrangigen-Zeitschriften.