Identifizierung der leukämischen Stammzellnische.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine sehr aggressive Blutkrebserkrankung welche ihren Ursprung in den Blutstammzellen des menschlichen Knochenmarks hat. Durch genetische Veränderungen in diesen Blutstammzellen entstehen sog Leukämie- Stammzellen (LSCs). Diese Zellen erwerben die Eigenschaft zur Selbsterneuerung (engl. self-renewal) und sind somit für die Vermehrung der eigentlichen Leukämiezellen verantwortlich. Um eine Leukämie effektiv zu behandeln, und somit einem frühzeitigen Relaps der Erkrankung vorzubeugen, müssen jedoch vor allem diese Leukämie- Stammzellen durch eine optimale AML-Therapie eliminiert werden. Unglücklicherweise zerstören die eingesetzten Chemotherapeutika meist nur aktive Leukämiezellen. Leukämie-Stammzellen jedoch können sich der Wirkung der Chemotherapie sehr effizient entziehen. Ein wichtiger, allerdings kaum erforschter Mechanismus, wie sich Leukämie- Stammzellen vor Chemotherapie schützen erklärt sich über ihre einzigartigen Interaktionen mit Stromazellen in der Knochenmarks-Nische. Wir werden in diesem Projekt durch Verwendung von synthetischen Notch- Rezeptoren (SynNotch receceptors), ein neuartiges, innovatives Konzept verfolgen, um die Interaktionen zwischen Leukämiestammzellen mit Knochenmarksnischenzellen besser zu erforschen. Synthetische Notch-Rezeptoren ähneln in ihrer Struktur herkömmlichen Notch-Rezeptoren, jedoch kann man sowohl die extrazelluläre Domäne, welche für die Erkennung des Liganden verantwortlich ist, als auch die intrazelluläre Signalvermittlung verändern. Dadurch können bestimmte Signale an der Zelloberfläche in der gezielten Expression ausgewählter eingebrachter Fluroreszenzproteine münden. Unser Ziel ist es Knochenmarks-Stromazellen, welche mit Leukämie-Stammzellen interagieren, mittels SynNotch-vermitteltem, direkten Zellkontakt zu markiert. Diese Kontakt-vermittelte Markierung erlaubt uns im Anschluss diese Zellen zu isolieren und somit mittels single-cell RNA profiling spezifische Interaktionsmechanismen zu entschlüsseln. Diese einzigartige Methode wird uns erstmals ermöglichen, genaue Einblicke in die Resistenzmechanismen der Leukämie-Stammzellen zu bekommen und dadurch effektivere Therapiekonzepte zur Bekämpfung der AML zu entwickeln.

Dieses Projekt ging von einer einfachen, aber grundlegenden Frage aus: Welche Zellen im Knochenmark "beherbergen" gesunde Blutstammzellen und leukämische Stammzellen? Zu wissen, welche Zellen diese "Gastgeber" sind, ist entscheidend, um zu verstehen, wie Leukämie entsteht, Leukämiezellen sich gegen Therapien schützen und Rückfälle verursachen. Das Ziel wäre Strategien zu entwickeln, die nicht nur die Krebszellen selbst, sondern auch deren "Zuhause" gezielt angreifen. Um diesen Fragen nachzugehen haben wir eine innovative Technologie namens synthetischer Notch-Rezeptor (SynNotch-Rezeptor) angepasst. Vereinfacht gesagt werden Knochenmarkstromazellen (die "Gastgeberzellen") genetisch mit einem künstlichen Oberflächenrezeptor ausgestattet, der ein Signal auf benachbarten Blut- oder Leukämiezellen erkennt. Sobald physischer Kontakt entsteht, schaltet die Stromazelle über den SynNotch-Rezeptor ein stark fluoreszierendes Signal an. Dadurch werden die interagierenden Stromazellen sichtbar und können angereichert und anschließend noch detaillierter untersucht werden. Wir haben erfolgreich CRISPR-Cas9 Genome Engineering und unterschiedliche virale Werkzeuge eingesetzt, um SynNotch-Rezeptoren in das Genom von Knochenmarkstromazellen einzufügen. Das System wurde umfrangreich optimiert, dass unerwünschte Hintergrundaktivierungen reduziert werden konnte, und somit wirklich nur echter direkter, physischer Zell-zu-Zell-Kontakt das Signal auslöst. Dazu haben wir verschiedene Rezeptor-Designs (ursprüngliche vs. verbesserte Versionen mit weniger Hintergrundrauschen), unterschiedliche Zelltypen und verschiedene Arten der Präsentation des aktivierenden Signals umfassend getestet. Dabei mussten mehrere zeitraubende Herausforderungen überwunden werden, um schließlich zeigen zu können, dass gentechnisch veränderte primäre Stromazellen tatsächlich den Fluoreszenzreporter aktivieren können, wenn sie mit Modell-Leukämiezellen zusammengebracht werden. Unsere Experimente verdeutlichten ein wichtiges Problem: Versionen des Systems, die sehr "sauber" sind (also wenig Hintergrundsignal erzeugen), lassen sich auch schwerer aktivieren. Dieses erworbene Wissen hat schließlich die entscheidenden Experimente möglich gemacht, mit denen Stromazellen charakterisiert werden konnten, die physisch mit menschlichen Blut- und leukämischen Stammzellen interagieren.