Charakterisierung humaner Stimmlippen-Fibroblasten

Einführung Stimmlippen (SL)-Fibroblasten sind der zentrale Zelltyp der Lamina propria und spielen eine zentrale Rolle, nicht nur unter physiologischen Bedingungen, sondern auch nach Verletzungen und bei Vernarbungs-Prozessen. Über das Verhalten menschlicher SL- Fibroblasten aus vernarbten oder intakten SL ist nur wenig bekannt, da diese Zellen bisher nicht zugänglich waren. Das bisherige Wissen über die Narbenbildung und Veränderungen der extracellulären Matrix (ECM)-Produktion nach SL-Verletzungen stammt zumeist aus Tiermodellen. Der nächste Schritt muss sein, diese Erkenntnisse mit menschlichen SL validieren. Ziele Das übergeordnete Ziel des Projekts ist eine Charakterisierung menschlicher SL- Fibroblasten aus vernarbten und normalen SL in einem größeren Kollektiv. Wir testen die Hypothese, dass sich SL-Fibroblasten aus vernarbten und normalen menschlichen SL morphologisch, bzgl. Wachstums-Eigenschaften, sowie in der Produktion von ECM- Komponenten und in puncto Genexpression unterscheiden. Methodik In Zusammenarbeit mit Prof. Stellan Hertegård MD, PhD vom Karolinska Institut, Stockholm, Schweden (Department of Clinical Science, Intervention and Technology) planen wir die Charakterisierung humaner SL-Fibroblasten (vernarbt und unvernarbt) aus bereits vorhandenen SL-Biopsien (n = 8). Eine Genehmigung der zuständigen Ethikkommission liegt bereits vor. Die SL-Fibroblasten werden nach etablierten Protokollen in Zellkultur extrahiert und in verschiedenen Work-Packages exploriert. Von Interesse sind morphologische und Wachstums-Parameter, Expressionsmuster mehrerer ECMKomponenten, sowie Gen- Expressions-Muster. Die Methoden umfassen quantitative (Western-Blot und RT-PCR) und qualitative (Immunzytochemie) Verfahren, sowie Microarray Analysen. Zielparameter sind die Mengen produzierter ECM-Bestandteile, sowie Gen-Cluster Analysen. Die gewonnen Daten werden inter-und intra-individuell verglichen und werden unter besonderer Berücksichtigung der erhobenen Daten aus den Krankenakten interpretiert. Innovation Ziel unseres Versuches ist die molekularbiologische und molekulargenetische Charakterisierung vernarbter und unvernarbter humaner SL-Fibroblasten. Unsere Arbeit soll erheblich dazu beitragen, grundlegende Kenntnisse über das Verhalten dieser wichtigen Zell-Population zu gewinnen. Somit soll eine solide Basis für die weitere Erforschung der zellulären und molekularen Mechanismen dieser Zellen geschaffen werden. Menschliche SL- Fibroblasten sind einzentrales Ziel für die zukünftigeEntwicklungvon Behandlungsstrategien und müssen näher spezifiziert werden. Dies muss in größeren Serien getan werden, da primäre Zelllinien erhebliche Schwankungen aufweisen.

Stimmlippenfibroblasten (SLF) bilden den essentiellen zellulären Bestandteil der Stimmlippen (SL). Sie sorgen für eine ausreichende Produktion bestimmter Proteine die für eine normale Schwingungsfähigkeit während der Stimmproduktion (Phonation) notwendig sind. Chronische Stimmlippennarben sind ein bis dato nicht kausal behandelbares Krankheitsbild, das für den Betroffenen mit einer lebenslangen Heiserkeit einhergeht. Ursachen dafür sind chronische Entzündungen und vorausgegangene OPs (v.a. Tumor-Operationen). Aufgrund der erschwerten Zugänglichkeit und der schwierigen Gewinnung von humanen SLF ist über die kausalen Ursachen der SL-Narben wenig bekannt. Ziel des Projektes war eine Charakterisierung der SLF, welche aus chronischen SL-Narben, sowie aus gesunden SL ein- und desselben Patienten gewonnen wurden. Mikroskopische Untersuchungen zeigten keinen Unterschied in der äußeren Form der verschiedenen Zellen, auch wichtige Parameter wie bsw. Wachstumsverhalten waren ähnlich. Auf Genebene konnte an Narben-Zellen unter Stimulation mit einem antifibrotischen Medikament (HGF) eine Aktivitätszunahme bestimmter Gene festgestellt werden, die im Zusammenhang mit Gewebe-Umbau stellen. Dies bedeutet, dass auch diese Zellen -nach jahrelangem Bestehen der Stimmlippennarbe- auf eine Therapie mit diesem Medikament prinzipiell ansprechen. Eine Analyse der Oberflächenrezeptoren (flow cytometry) erbrachte keinen Hinweis auf das Vorhandensein des sog. c-met Rezeptors an welchen HGF üblicherweise bindet. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass an SLF ein anderer Wirkmechanismus vorliegt. Ein aufbauendes Projekt soll die Ausschüttung von zahlreichen Proteinen klären welche normale und vernarbte SLF bilden (Proteomics)