Engineering einer a2,6-Sialyltransferase aus H. acinonychis

Das Projekt Enzyme Engineering of an a2,6-Sialyltransferase from Helicobacter acinonychis for Sialylation of Therapeutic Proteins handelt vom Erforschen und Engineering der Sialyltransferase HAC1268 des Bakteriums Helicobacter acinonychis. Sialyltransferasen sind Enzyme die Neuraminsäuren zu vielen unterschiedlichen Empfänger Molekülen transferieren. Diese Zuckersäuren spielen eine wichtige Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, die mit Erkrankungen beim Menschen in Beziehung stehen. In letzter Zeit erhält die Entwicklung von therapeutischen Proteinen zur Behandlung von zahlreichen Krankheiten zunehmend mehr Bedeutung. Hier ist vor allem die richtige Glykosylierung besonders wichtig, nachdem strukturelle Instabilitäten ein Problem bedeuten und die therapeutische Effizienz negativ beeinflussen könnten. Die Modifizierung von therapeutischen Proteinen mit konstruierten, sialylierten Glykanen bietet eine vielversprechende und elegante Möglichkeit dieses Problem zu überwinden. Daher ist die detailierte Charakterisierung von Sialyltransferasen für den Transfer von Neuraminsäuren genauso wie Zugänge durch Engineeringum verbesserte Enzyme zu erhalten von besonderer Bedeutung für die Forschergemeinschaft. Die gewählte a2,6-sialyltransferase HAC1268 ist von besonderem Interesse, da sie den Transfer einer Neuraminsäure auf menschliche Glykoproteine katalysiert und geeignet für das Engineering von therapeutischen Proteinen mit menschenähnlicher Glykosylierung, die vom menschlichen Organismus toleriert wird, ist. HAC1268 ist bisher das einzige Enzym mit dieser Spezifität innerhalb einer speziellen Gruppe von Zuckertransferasen. Dieses neuartige Enzym soll im Labor von Prof. Warren W. Wakarchuk an der Ryerson Universität in Toronto untersucht werden, da dort das notwendige Expertenwissen bereit gestellt werden kann. Unsere Hypothese lautet, dass eine detailierte Charakterisierung des Enzyms durch Mutationsanalyse signifikantes Wissen zum Verständnis dieser Enzymfamilie beitragen wird. Durch gerichtete Evolution soll die Stabilität, Aktivität und Substratspezifität des Enzyms optimiert werden und verbesserte mutierte Enzyme sollen auf ihre Fähigkeit therapeutische Proteine mit Neuraminsäure zu modifizieren, um eine verbesserte Stabilität und Halbwertszeit zu erhalten, getestet werden. Dieses Projekt soll Licht in die Mechanismen einer speziellen Gruppe von Sialyltransferasen bringen und neue Möglichkeiten für die Erschaffung von humanisierten therapeutischen Proteinen für eine mögliche medizinische Anwendung in der Zukunft öffnen.

Das Projekt Enzyme Engineering of an a2,6-Sialyltransferase from Helicobacter acinonychis for Sialylation of Therapeutic Proteins handelt vom Erforschen und Engineering der Sialyltransferase HAC1268 des Bakteriums Helicobacter acinonychis. Sialyltransferasen sind Enzyme die Neuraminsäuren zu vielen unterschiedlichen Empfänger Molekülen transferieren. Diese Zuckersäuren spielen eine wichtige Rolle in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen, die mit Erkrankungen beim Menschen in Beziehung stehen. In letzter Zeit erhält die Entwicklung von therapeutischen Proteinen zur Behandlung von zahlreichen Krankheiten zunehmend mehr Bedeutung. Hier ist vor allem die richtige Glykosylierung besonders wichtig, nachdem strukturelle Instabilitäten ein Problem bedeuten und die therapeutische Effizienz negativ beeinflussen könnten. Die Modifizierung von therapeutischen Proteinen mit konstruierten, sialylierten Glykanen bietet eine vielversprechende und elegante Möglichkeit dieses Problem zu überwinden. Daher ist die detailierte Charakterisierung von Sialyltransferasen für den Transfer von Neuraminsäuren genauso wie Zugänge durch Engineeringum verbesserte Enzyme zu erhalten von besonderer Bedeutung für die Forschergemeinschaft. Eine neue a2,6-Sialyltransferase von Helicobacter wurde im Labor von Prof. Warren W. Wakarchuk an der Ryerson Universität in Toronto untersucht. Unser ursprünglicher Plan, gerichtete Evolution zur Erzeugung von Mutanten von HAC1268 und ein FACS basierendes High-throughput Screening der Mutantenbibliothek zu verwenden, führte zu einer Akkumulation von Klonen mit höherer Aktivität, die allerdings keine Mutationen im Gen aufwiesen und deren erhöhte Aktivität von Änderungen im Vektor-Rückgrat stammten. Wir mussten daher das Projekt ändern und verwendeten einen rationalen Konstruktionsansatz an einem nicht charakterisierten, aber ähnlichen Enzym (79% Sequenzidentität) aus Helicobacter cetorum und verglichen dieses Enzym mit einer humanen ST6Gal1 und einer Photobacterium sp. Sialyltransferase unter Verwendung von Glykoproteinsubstraten in einem 96-well Mikrotiterplatten basierenden Test. Auf diese Weise konnten wir zeigen, dass die rekombinante a2,6-Sialyltransferase aus H. cetorum ein hervorragender Katalysator für die Modifikation von N-verknüpften Glykanen an verschiedenen therapeutischen Proteinen ist.