Struktur/Funktionsbeziehungen am Serotonin Transporter

Forschungsprojekt P 14509 Struktur/Funktionsbeziehungen am Serotonin TrasporterHarald H. SITTE27.11.2000 Neurotransmittertransporter (NT) sind Membranproteine, die für Wiederaufnahme von freigesetzten Neurotransmittern aus dem synaptischen Spalt verantwortlich sind. Prototypisch zu nennen sind der Serotonin- und GABA-Transporter (SERT bzw. GAT-1), die im gegenständlichen Projekt untersucht werden sollen. Es ist sowohl Einwärts- wie Auswärtstransport bekannt, letzerer trägt zur nicht-exozytotischen Freisetzung von Neurotransmittern bei. Transport ist Na+-Ionen-abhängig und assoziiert mit einem Na+-Strom, der in Analogie zu Ionenkanälen steht; weiters bilden NT ebenfalls oligomere Strukturen aus, was kürzlich indirekt nachgewiesen wurde. Wir möchten in diesem Projekt den oligomeren Status des SERT mittels Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer- Mikroskopie (FRET-M) untersuchen; dieses ist die Methode der Wahl, um Protein-Trotein Interaktionen in lebenden Zellen zu untersuchen; dieses ist die Methode der Wahl, um Protein-Protein Interaktionen in lebenden Zellen zu untersuchen. FRET tritt auf, wenn (i) zwei Fluorophore in geringem Abstand (<100 A) und (ii) passender räumlicher Orientierung zueinander stehen, damit ein Donor-Fluorophor Energie auf einen Akzeptor-Fluorophor längerer Wellenlänge übertragen kann. Das grün Fluoreszierende Protein (FP) wurde kürzlich dahingehend verändert, um pasende Paare für FRET-M zu erzeugen (z.B. cyan- und gelb-FP). Um Interaktionen zu studieren werden FP-transporter Fusionsproteine erzeugt. Um die Spezifität des FRET-M Signals zu untersuchen, werden Ko-Transfektionsexperimente unternommen (YFP-GAT1-CFP-SERT). Um die FRET-M-Daten zu bestätigen werden FPLC-und native PAGE durchgeführt. Gemäß unserer Arbeitshypothese nehmen wir an, daß (i) transportierte Substrate und nicht-transportierte Liganden unterschiedliche oligomere Zustände hervorrufen; dies wollen wir mittels FRET-M in intaktem Zellen untersuchen. Feinere Konfrontationsänderungen innerhalb des NT können mit intramolekularem FRET, durch Fusion eines Donors bzw. Akzeptors an N- bzw. C-Terminus, sichtbar gemacht werden. Es wird angenommen, daß (ii) Oligomerisierung von spezifischen Protein-Protein- Interaktionsstellen abhängt, dem sog. Leuzin-Reißverschluß-Motiv. Dessen funktionelle Relevanz für die Oligomerisierung soll durch chimäre NT bestimmt werden. (iii) Dynamische Veränderungen in der Subzellulär- Verteilung der NT sollen durch FRET-M sichtbar gemacht werden. SERT wird nach Phosporylierung durch Protein-Kinasen internalisiert. Daher sollen Pfade des NT-Recyclings durch verschiedene beeinflussende Maßnahmen mittels FRET-M untersucht werden. Nachdem der SERT höchste Relevanz hinsichtlich klinischer Pharmakotherapie (z.B. Antidepressiva) und Drogenmißbrauchs (ecstasy) besitzt, ist dieser Projektantrag auf die Visualisierung des SERT und seines funktionellen Status in intakten Zellen dokussiert, um die Mechanismen, denen seine Arbeitsweise und Regulation unterliegen, besser zu verstehen.

Neurotransmitter Transporter beendigen die neuronale Transmission. Dazu wird der freigesetzte Neurotransmitter einfach wieder in die Zelle zurück aufgenommen, als treibende Kraft wird der existierende Natriumgradient über die Membran genutzt. Es ist bekannt, dass Neurotransmitter Transporter in einer bestimmten Quartärstruktur organisiert sind. Jedoch wurden diese Resultate relativ harsch erhoben und daher war unklar, ob Neurotransmitter Transporter oligomere Strukturen an der Oberfläche von lebenden Zellen bilden. Daher wurde das gegenständliche Projekt unter folgende Arbeitshypothesen gestellt: (1) Neurotransmitter Transporter liegen in lebenden Zellen in oligomerer Struktur vor und (2) diese ist für ihre funktionelle Aktivität von essentieller Bedeutung. Um diese Ziele zu erreichen, führten wir Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer Mikroskopie in unserem Institut und dem Feld der Neurotransmitter Transporter Wissenschaft ein. Damit war es uns möglich nachzuweisen, dass die Transporter konstitutiv, das heißt ständig als Oligomer vorliegen. Weiters untersuchten wir unterschiedliche Stellen in den Transportern für Serotonin und Gamma-aminobuttersäure (GABA), die als Oligomerisierungs- lnteraktionsstellen zur Verfügung stehen. Wir fanden, dass eine Leuzin-reiche Region in der Transmembrandomäne 2 eine wichtige Rolle in der Oligomerisierung des GABA-Transporters spielte. Veränderung dieses Motifs durch Mutation der Leuzine zu Alaninen resultierte in einem Verlust der Oligomerisierung, wodurch die Transporter intrazellulär retiniert wurden. Wir beobachteten daraufhin die Bedeutung der Oligomerisierung für den geregelten Export aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER): Nur ordnungsgemäß oligomerisierte Transporter können die strenge Qualitätskontrolle passieren und werden aus dem ER entlassen. Allerdings ist oligomere Struktur nicht genug Voraussetzung, um an die Zelloberfläche zu gelangen: Transportproteine benötigen dazu weiters eine Interaktion mit einer Komponente der vesikulären Cargo-maschinerie, den sogenannten COPII-Vesikeln. Diese sind für den Transport von frisch gebildeten Proteinen vom ER zum Golgi Apparat und weiter zu der Zelloberfläche verantwortlich, In funktioneller Hinsicht benötigen die Transporter die Oligomerisierung nicht für die Wiederaufnahme, jedoch brauchen sie dieses strukturelle Arrangement für die transporter-vermittelte Freisetzung. Und dies bildet die Basis unseres Beitrages zum besseren Verständnis der Wirkungen von Amphetaminen (wie z.B. Methylene-dioxymethamphetamine = Ecstasy).