Cellobiose-Oxidoreduktasen von Sclerotium (Athelia) rolfsii

Forschungsprojekt P 14537Cellobiose-Oxidoreduktasen von Sclerotium (Athelia) rolfsiiDietmar HALTRICH26.06.2000 Cellobiose-Oxidoreduktasen sind extrazelluläre Enzyme, die von zahlreichen, unterschiedlichen Pilzen gebildet werden und die voraussichtlich am Abbau von Cellulose und/oder Lignin beteiligt sind. Man unterscheidet hier die beiden Enzyme Cellobiose-Dehydrogenase (CDH), die sowohl ein FAD als auch ein Häm b als prosthetische Gruppe trägt, und Cellobiose: Quinon Oxidoreduktase (CBQ), die voraussichtlich durch proteolytische Spaltung der CDH entsteht, nur noch FAD als prosthetische Gruppe besitzt, aber bis auf wenige Ausnahmen vergleichbare katalytische Eigenschaften aufweist. Zur Zeit ist die genaue Funktion dieser Enzyme noch umstritten. Im Zuge von Vorarbeiten konnten wir zeigen, daß der pflanzenpathogene Pilz Sclerotium (Athelia) rolfsii einer der besten Produzenten von Cellobiose-Oxidoreduktasen ist und je nach Wachstumsbedingungen signifikante Mengen an CDH oder CBQ produziert (mehrere 100 mg pro Liter Fermenationsmedium!). Diese gute Verfügbarkeit der Enzyme ist eine wichtige Voraussetzung für das hier beantragte Projekt. Im Rahmen des Projektes sollen die folgenden Aspekte detailliert untersucht werden: [1] Physiologie der Bildung von CDH und CBQ (Bedingungen, unter denen vorwiegend CDH oder CBQ gebildet wird; Einfluß des pH-Wertes, der N-Quelle, des C/N- Verhältnisses, von Proteaseaktivität; stimulierender Effekt von aromatischen Verbindungen); [2] Reingung und Charakterisierung von sowohl CDH als auch CBQ (Molekulargewicht; pI; prosthetische Gruppen; Glykosylierung; Substratspezifität für Zucker und unterschiedliche Elektronenakzeptoren, mit Schwerpunkt auf unterschiedlich substituierten Benzochinonen); [3] enzymologische Studien von sowohl CDH als auch CBQ (kinetischer Mechanismus; Struktur/Funktionsbeziehungen vorwiegend für die reduktive Halbreaktion; Rolle von Enzym/Substratinteraktionen für Ligandenerkennung und Spezifität; Reaktionsmechanismus für das Häm- sowie das Nicht-Häm-Protein mit speziellem Schwerpunkt auf dem intramolekularen Elektronentransport von Flavin auf Häm); und [4] Reaktionstechnik des Einsatzes von CDH/CBQ für die kontinuierliche Oxidation von Lactose, einem Reststoff der Molkereiwirtschaft, zu Lactobionsäure, einer Verbindung mit möglichen Anwendungen in der Pharmazie, der Lebensmitteltechnologie und als Industriechemikalie (Verwendung unterschiedlicher Redoxmediatoren; kontinuierliche Regeneration dieser Mediatoren durch pilzliche Laccasen; Charakterisierung dieses regenerativen Enzyms; diskontinuierliche und kontinuierliche Umsetzungsversuche; Simulation der Umsetzungen).

Cellobiose-Dehydrogenase (CDH) ist ein Enzym das für den Abbau von Lignocellulose (Holz) von Bedeutung ist, allerdings ist dieses Enzym noch nicht im Detail untersucht wurden und die genau Funktion ist auch noch nicht bekannt. CDH ist ein extrazelluläres Enzym, das zwei prosthetische Gruppen trägt, eine Häm- und eine Flavin- Gruppe, die beide für die Funktion des Enzyms als Oxidoreduktase von Bedeutung sind. CDH oxidiert unterschiedliche Zucker, die beim Abbau von Lignocellulose entstehen (etwa Cellobiose), gleichzeitig werden unterschiedliche Verbindungen wie Chinone (toxische Verbindungen die beim Abbau von Lignin freigesetzt werden und die zur vollständigen Metabolisierung reduziert werden müssen) oder komplexierte Metallionen reduziert. CDH wird durch verschiedene Pilze unter induktiven Bedingungen gebildet, d.h., der Induktor Cellulose muss in unmittelbarer Nachbarschaft des Organismus vorliegen um nennenswerte CDH-Bildung zu erzielen. Zur Zeit wurde CDH nur von relativ wenigen Pilzen untersucht. Der Schwerpunkt des Projektes lag bei Cellobiose-Dehydrogenase des phytopathogenen Pilzes Sclerotium rolfsii, einem Pflanzenschädling, der eine Reihe von wichtigen Kulturpflanzen befällt. Auch beim Mechanismus der Pathogenese dürfte CDH eine wichtige Rolle spielen. Durch Untersuchung der physiologischen Bedingungen unter denen das Enzym bevorzugt gebildet wird konnten wir Ausbeuten von bis zu 250 mg CDH pro Liter Fermentationsmedium erzielen, damit ist CDH sowohl für Grundlagen- als auch für angewandte Forschung in ausreichendem Maße verfügbar. Zusätzlich haben wir auch die Bildung von CDH durch andere Pilze untersucht. In einem Screening-Programm, in dem eine Reihe von Weissfäulepilzen auf CDH untersucht wurden, konnten wir feststellen, dass in diesen Organismen CDH sehr häufig vorkommt, CDH dürfte also eine wichtige, bislang noch unterschätzte Rolle am Abbau von Lignocellulose besitzen. Weissfäulepilze sind die wichtigsten Organismen, die für den Abbau von Lignocellulose verantwortlich sind, sie haben in der Natur eine bedeutende Rolle beim Recycling von Lignocellulose. CDH wurde in einem neuen, biokatalytischen Prozess zur Herstellung von Lactobionsäure eingesetzt. Lactobionsäure hat eine Reihe von potentiellen Anwendungen in der Lebensmitteltechnologie oder als wiedererneuerbare Ausgangssubstanz für Polymere.