Lipolyse und inflammatorische Prozesse in Endothelzellen

Die Endothel Lipase (EL) gehört der Triglyzerid-Lipase-Gen-Familie an und wird in Endothelzellen, als auch anderen verschiedenen Zelltypen synthetisiert. Die enzymatische Wirkung der EL auf das anti-atherogene Lipoprotein HDL erzeugt eine komplexe Mischung von bioaktiven Molekülen (EL/HDL-Mischung), die aus gesättigten und ungesättigten, freien Fettsäuren (FFS) und Lysophospholipiden (lyso-PC) besteht. Diese lipolytischen Spaltprodukte induzieren in arteriellen Endothelzellen der humanen Plazenta (HPAEC) und der humanen Aorta (HAEC) die Expression von inflammatorischen Genen, wie etwa VCAM-1, E-selectin, Interleukin- 6 (IL-6) und RANTES. Da eine unkontrollierte Expression der genannten inflammatorischen Gene in Endothelzellen zur verstärkten Adhäsion von Monozyten an das vaskuläre Endothel und in weiterer Folge zur Initiation von Atherosclerose führt, wurden folgende Ziele gesetzt: 1. Untersuchung des relativen Einflusses von EL-generierten FFS und Lyso-PCs auf die Expression inflammatorischer Gene in Endothelzellen. 2. Identifizierung von beteiligten intrazellulären Signalkaskaden und Transkriptionsfaktoren, die durch EL- generierten FFS und Lyso-PCs in Endothelzellen aktiviert werden und damit inflammatorische Gene induzieren. 3. Analyse der funktionellen Folgen, die durch die verstärkte Genexpression inflammatorischer Gene in Endothelzellen auftreten. Zu diesem Zweck wird die Expression inflammatorischer Gene mittels real-time RT-PCR, Western blot und ELISA in HPAEC und HAEC, die zuvor mit FFS und Lyso-PC inkubiert wurden, untersucht. Der Effekt von Lyso- PCs auf die Expression von inflammatorischen Ziel-Genen wird mittels Immunofluoreszenz, in vivo in Mäusen untersucht, denen Lyso-PC injizierten wurde. Die beteiligten Signalkaskaden und Transkriptionsfaktoren werden mittels pharmakologischer Inhibitoren der Signalkaskaden, decoy Oligonucleotiden, sowie DNA/Protein Microarray-Techniken identifiziert. Zur Ermittlung der funktionellen Folgen der induzierten Expression der Ziel- Gene, wird die Adhäsion von Monozyten an die mit FFS und lyso-PC behandelten Endothelzellen untersucht. Zusätzlich, wird die Expression der inflammatorischen Ziel-Gene und die damit verbundene Adhäsion von Monozyten ex vivo in Aortasegmenten von EL-defizienten und Wildtyp-Mäusen untersucht. Die Identifizierung der beteiligten Signalkaskaden und Transkriptionsfaktoren, die für die FFS and Lyso-PC induzierte Expression inflammatorischer Gene verantwortlich sind, sollte einen wesentlichen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der Inflammation in der Gefäßwand darstellen. Die Ergebnisse dieser Studie könnten in weiterer Folge eine Basis für die pharmakologische Prävention und Behandlung von Atherosklerose darstellen.

Das vorliegende Projekt hatte sich zum Ziel gesetzt, Endothelzell-generierte bioaktive Lipide (Lysophosphatidyl- choline, LPC) in Bezug auf deren Potential die Funktion der Endothelzellschicht zu modulieren zu charakterisieren. Valskuläre Endothelzellen stellen eine aktive und wichtige Barriere zwischen dem zirkulierenden Blut und den tieferen Schichten der Gefäßwand dar. Gesunde Endothelzellen produzieren vasoprotektive Stoffe, welche die Aufrechterhaltung des physiologischen Gefäßtonus und des Blutdruckes gewährleisten. Diese vasoprotektiven Stoffe hemmen Entzündungsprozesse als auch überschießende Blutgerinnung und verhindern dadurch die Entstehung von Arteriosklerose. Viele Faktoren wie erhöhte Blutglukose, oxidierte Lipide, Fettsäuren oder eben die von uns untersuchten bioaktive Lipide können die Funktion des Endothels negativ beeinflussen. Unsere Studie fokussierte sich dabei auf eine Klasse strukturell ähnlicher bioaktiver Lipide (LPCs) mit unterschiedlicher Fettsäure Komposition, und deren Potential, die Endothelzell-Funktion zu modulieren. Die Experimente dazu wurden in kultivierten Endothelzellen der Aorta menschlichen Ursprungs durchgeführt. Die getesteten bioaktiven Lipide stellen natürliche Bestandteile des Blutes dar, welche unter inflammatorischen Bedingungen massiv ansteigen. Diese Lipide zeigten zweierlei Effekte: Einerseits förderten sie die Produktion vasoprotektiver Substanzen von Endothelzellen, andererseits stimulierten sie die Zellen ebenfalls dazu schädliche pro-inflammatorische Moleküle zu generieren. Das Ausmaß und die Dauer der durch die Testkomponenten bewirkten Effekte stand in Relation zu deren strukturellen Unterschieden (Fettsäure-Komposition). Interessanterweise ergab die Analyse des molekularen Wirkungsmechanismus keinerlei Unterschiede zwischen den untersuchten Lipidspezies. Deshalb ist es sehr wahrscheinlich, dass diese bioaktiven Lipide sowohl positive als auch negative Effekte auf die Gefäßwand ausüben. Deshalb würde ein therapeutisches pharmakologisches Produkt auf Basis der getesteten Lipide nicht nur die Produktion vasoprotektiver Substanzen verbessern, sondern gleichzeitig auch die Produktion entzündlicher Mediatoren mit sich bringen. Vice versa würde die pharmakologische Inhibition der Funktion der getesteten Lipide nicht nur deren pro-inflammatorische Wirkung beseitigen, sondern auch deren positive Wirkungen auf die Gefäßwand ausschalten. Es ist jedoch zu betonen, dass unsere Resultate in Zellkultur-Systemen generiert wurden, ohne die in vivo gegebenen komplexen Wechselwirkungen mit Blutkomponenten und anderen Zellarten der Gefäßwand miteinzubeziehen. Es wäre jedoch von höchstem Interesse, herauszufinden unter welchen (patho)physiologischen Bedingungen die positiven und negativen Effekte in vivo balanciert bzw. unausgeglichen vorzufinden sind. Diese überaus aufschlussreichen funktionellen Implikationen sollen darum im Anschluss in einem Folgeprojekt in in vivo und ex-vivo Experimenten behandelt werden.