Molekulare Analyse des Fusionsmechanismus von Flaviviren

Die Verschmelzung der Virusmembran mit einer zellulären Membran (Fusion) ist ein essentieller Schritt im Lebenszyklus umhüllter Viren und ermöglicht die Freisetzung ihrer genetischen Information in das Zytoplasma. Dieser Prozess wird von strukturell sehr unterschiedlichen viralen Membranproteinen (Fusionsproteinen) vermittelt, die - als Antwort auf einen spezifischen Auslöser ("Trigger") - ihre Konformation dramatisch verändern und dadurch die Verschmelzung der beiden Membranen bewirken können. Im Rahmen des vorliegenden Antrags sollen bisher unbekannte Details der Fusionsmaschinerie von Flaviviren erforscht werden. Flaviviren sind kleine umhüllte Viren und umfassen neben dem Frühsommermeningoenzephalitis (FSME) Virus - unser Modellsystem - noch weitere wichtige humanpathogene Viren wie z.B. das Gelbfieber Virus, die Dengue Viren, das West Nil Virus und das Japanische Enzephalitis Virus. Diese Viren dringen über Rezeptor-vermittelte Endozytose in die Zelle ein, und die Fusion wird durch den sauren pH in Endosomen ausgelöst. Die atomaren Strukturen löslicher Formen des Fusionsproteins E wurden mittels Röntgenbeugungsanalyse ermittelt, aber wichtige Elemente fehlen in diesen Strukturen, nämlich der Transmembrananker und die so genannte Stamm-Region, die für Interaktionen in bestimmten Stadien des Fusionsprozesses entscheidend sind. Zwei wichtige Aspekte des Flavivirus Fusionsmechanismus sollen im Zuge dieses Projekts untersucht werden: 1) Was ist die molekulare Basis des Fusionstriggers, d.h. welche Aminosäuren in E müssen protoniert werden, um die für die Fusion erforderlichen Konformationsänderungen auszulösen; und 2) welche Rolle spielt die Stamm-Region in den späten Stadien des Fusionsprozesses. Für beide Zielsetzungen werden rekombinante Virus-ähnliche Partikel verwendet, die durch spezifische Mutagenese verändert werden. Die mutierten Partikel werden anschließend in einer Reihe von biochemischen und funktionellen Tests analysiert, mit dem Ziel, neue Informationen über den detaillierten Ablauf des Fusionsprozess zu erhalten. Diese Studien sollten es ermöglichen, bis jetzt nicht fassbare Fusionsintermediate zu identifizieren und neue Erkenntnisse über den molekularen Fusionsmechanismus von Flaviviren zu gewinnen. Die genaue Kenntnis der einzelnen Schritte dieses Prozesses kann einen wichtigen Beitrag zur gezielten Entwicklung antiviraler Agenzien leisten.

Die Verschmelzung der Virusmembran mit einer zellulären Membran (Fusion) ist ein essentieller Schritt im Lebenszyklus umhüllter Viren und ermöglicht die Freisetzung ihrer genetischen Information in das Zytoplasma. Dieser Prozess wird von strukturell sehr unterschiedlichen viralen Membranproteinen (Fusionsproteinen) vermittelt, die - als Antwort auf einen spezifischen Auslöser ("Trigger") - ihre Konformation dramatisch verändern und dadurch die Verschmelzung der beiden Membranen bewirken können. Im Rahmen des vorliegenden Antrags sollen bisher unbekannte Details der Fusionsmaschinerie von Flaviviren erforscht werden. Flaviviren sind kleine umhüllte Viren und umfassen neben dem Frühsommermeningoenzephalitis (FSME) Virus - unser Modellsystem - noch weitere wichtige humanpathogene Viren wie z.B. das Gelbfieber Virus, die Dengue Viren, das West Nil Virus und das Japanische Enzephalitis Virus. Diese Viren dringen über Rezeptor-vermittelte Endozytose in die Zelle ein, und die Fusion wird durch den sauren pH in Endosomen ausgelöst. Die atomaren Strukturen löslicher Formen des Fusionsproteins E wurden mittels Röntgenbeugungsanalyse ermittelt, aber wichtige Elemente fehlen in diesen Strukturen, nämlich der Transmembrananker und die so genannte Stamm-Region, die für Interaktionen in bestimmten Stadien des Fusionsprozesses entscheidend sind. Zwei wichtige Aspekte des Flavivirus Fusionsmechanismus sollen im Zuge dieses Projekts untersucht werden: 1) Was ist die molekulare Basis des Fusionstriggers, d.h. welche Aminosäuren in E müssen protoniert werden, um die für die Fusion erforderlichen Konformationsänderungen auszulösen; und 2) welche Rolle spielt die Stamm-Region in den späten Stadien des Fusionsprozesses. Für beide Zielsetzungen werden rekombinante Virus-ähnliche Partikel verwendet, die durch spezifische Mutagenese verändert werden. Die mutierten Partikel werden anschließend in einer Reihe von biochemischen und funktionellen Tests analysiert, mit dem Ziel, neue Informationen über den detaillierten Ablauf des Fusionsprozess zu erhalten. Diese Studien sollten es ermöglichen, bis jetzt nicht fassbare Fusionsintermediate zu identifizieren und neue Erkenntnisse über den molekularen Fusionsmechanismus von Flaviviren zu gewinnen. Die genaue Kenntnis der einzelnen Schritte dieses Prozesses kann einen wichtigen Beitrag zur gezielten Entwicklung antiviraler Agenzien leisten.