Mitochondriale Calcium Homeostase in Endothelzellen

Obwohl sich bald herausstellte, dass Mitochondrien aufgrund ihrer stark negativ geladenen inneren Membran zweifach positiv geladene Kalzium Ionen (Ca 2+) besonders gut aufnehmen können, hat man lange Zeit die Bedeutung dieser Zellorganellen für die Regulation zellulärer Ca2+ Signale unterschätzt. Heute weiß man, dass Mitochondrien nicht nur spezifisch auf Ca2+ reagieren sondern aktiv an der differenzierten Regulation der räumlich und zeitlichen Ausdehnung zellulärer Ca2+ Signale maßgeblich beteiligt sind. Damit hat sich das ursprüngliche Paradigma radikal gewandelt. Kürzlich konnten wir die Rolle der Mitochondrien für den Einstrom von Ca2+, die Füllung intrazellulärer Ca2+-Speicher und die Ca2+-abhängige Faltung von Eiweißmolekülen aufklären. Obwohl diese Studien zweifelsohne zu einem besseren Verständnis der Mitochondrien-Physiologie beitragen, lieferten sie keine essentiellen Hinweise auf jene Proteine, die tatsächlich für den Ca2+-Transport in den Mitochondrien verantwortlich sind. Welche molekularen Mechanismen für die Steuerung von Ca2+ Strömen an den Mitochondrien verantwortlich sind und wie andere Ionen diese Prozesse beeinflussen ist ebenso unbekannt. Im Rahmen unseres jetzigen Projektes beschrieben wir, dass zwei Vertreter aus der uncoupling protein family, nämlich UCP2 und UCP3, unentbehrlich für die Ca2+ Aufnahme in Mitochondrien sind (Trenker et al., Nature Cell Biology 2007). Daraus lässt sich ableiten, dass es sich bei dem für den Ca2+ Einstrom in das Mitochondrium verantwortlichen "Uniporter" um einen UCP2 bzw. UCP3-hältigen Multiproteinkomplex handelt, dessen genaue Zusammensetzung noch unklar ist. Daher wird im Arbeits-Paket A des eingereichten Forschungsantrages die Proteinzusammensetzung des mitochondrialen Ca2+ "Uniporters", die spezifischen Adaptation dieser Proteinkomplexe hinsichtlich der unterschiedlicher Ca2+ Quellen (intrazellulär freigesetztes Ca2+ bzw. einströmdendes Ca2+), und seine dynamische Regulation über Phsophorylierungsreaktionen an den UCP Proteinen untersucht. Unserer Ergebnisse, die eine Beteiligung von UCP2 und UCP3 am mitochondrialen Ca2+ "Uniport" belegen, stehen, oberflächlich betrachtet, im Gegensatz zu den bisherigen Befunden über die physiologische Konsequenz der UCP2/3 Aktivität. Um diesen scheinbaren Widerspruch zu beseitigen, wird im Arbeits-Paket B die von uns aufgeklärten molekularen Funktion von UCP2 und UCP3 auf die mitochondriale ATP und Radikalproduktion, als Grundlage aller bisherigen Befunde hinsichtlich der physiologischen Funktionen von UCP2 und UCP3, erforscht. Da die mitochondriale Ca2+ Homeostase untrennbar mit der des zellulären Na+ verbunden ist, wird im Arbeit- Paket C die funktionelle Interaktion mitochondrialer Ionentransporter mit Na+ transportierender Ionenaustauscher und Ionenkanäle in der Plasmamembran analysiert. Dabei wird auch die Rolle von ER Ca2+ Pumpen (SERCA) beurteilt. Dieses Projekt versucht die molekularen Mechanismen der mitochondrialen Ca2+ Homeostase aufzuklären und bestehende Widersprüche bezüglich der Mechanismen der durch UCP2 und UCP3 bewirkten physiologischen Effekte anhand der eben erst beschriebenen molekularen Aktivitäten dieser Proteine zu lösen. Obwohl dieses Projekt hauptsächlich in Endothelzellen als ein uns gut bekanntes Modellsystem bearbeitet wird, so werden die zu erwartenden Ergebnisse doch auch auf andere Zelltypen übertragbar sein und so als Grundlage für weitere Untersuchen dienen.

Das Projekt beschäftigte sich mit der Untersuchung der molekularen Mechanismen der Ca2+ Aufnahme in die Mitochondrien intakter Zellen. Dieser Mechanismus ist von größter physiologische Bedeutung für die Regulation unterschiedlicher Funktionen der Mitochondrien und konnte bislang zwar phänomenologisch beschrieben werden wobei die daran beteiligten Proteine bis vor kurzem nicht identifiziert waren. Ausgangspunkt dieser Studie waren von uns kurz zuvor publizierte Daten, die auf eine Beteiligung der neuen Entkopplungs-Proteine (uncoupling proteins; UCP) 2 und 3 hinwiesen und damit erstmals die molekulare Identität eines an der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme beteiligten Proteins entschlüsselten. Gemäß der Projektplanung wurde das Projekt in drei Bereichen bearbeitet. Im Arbeitsbereich A wurde die molekulare Zusammensetzung des UCP2/3-beinhaltenden Ca2+ Aufnahmeapparates der Mitochondrien mittels anspruchsvoller Proteinanalytik untersucht. Dabei konnten zehn Proteine isoliert werden, die mit dem in der inneren Mitochondrienmembran befindlichen UCP2 interagieren. Nach der Identifizierung dieser Proteine durch Massenspektroskopie wurde begonnen die funktionelle Bedeutung dieser Proteine für die mitochondriale Ca2+ Aufnahme zu untersuchen. In diesen Untersuchungen, die noch nicht vollständig abgeschlossen sind, konnte bereits ein Protein, welches essentiell für den UCP2/3-abhängigen Ca2+ Transporter in den Mitochondrien ist, beschrieben werden. In weiterer Folge konnten wir auch einen chemischen Hemmstoff dieses Proteins finden, der als Leitsubstanz zur Entwicklung neuer Pharmaka gegen mitochondrien-assoziierte Erkrankungen dienen könnte. Im Arbeitsbereich B wurde die Struktur-Wirkungs-Beziehung von UCP3 für dessen Beteiligung am mitochondrialen Ca2+ Transport untersucht. Dabei konnten zwei Motive der zweiten Intermembranschleife gefunden werden, die für die Ca2+ Sensitivität des UCP2/3-abhängigen Ca2+ Transporters in den Mitochondrien verantwortlich sind und damit dessen Aktivität zur Aufnahme des intrazellulär freigesetzten bzw. einströmenden Ca2+ definiert. Weiters wurden zwei weitere Ca2+ Transporter, die entweder Letm1- oder MICU1-abhängig waren beschrieben, wodurch es nun erstmals gelungen ist, die Existenz von drei molekular unterschiedlichen mitochondrialen Ca2+ Transportern zu zeigen. Im Arbeitsbereich C wurde die Bedeutung von Na+ für die mitochondriale Ca2+ Homöostase untersucht. Dabei zeigte sich, dass der mitochondriale Na+ /Ca 2+-Austauscher speziell unter Bedingungen exzessiver Ca2+ Signale von großer Bedeutung ist. In diesem Projekt wurden beträchtliche Fortschritte im Verständnis der molekularen Zusammensetzung und der Funktion mitochondrialer Ca2+ Transporter erzielt. Die Befunde werden als wichtige Basis für weiterführende Untersuchungen und für die Entwicklung neuer Therapeutika gegen mitochondrien-assoziierte Erkrankungen, wie Neurodegeneration, (Herz-)Muskelmyopahtien oder Gefäßstörungen dienen.