Struktur der Apolipoproteine B100 und VLDL-II

Plasmalipoproteine sind makromolekulare Komplexe aus Eiweiß und Fetten, einschließlich des Cholesterins, und spielen Schlüsselrollen in der Regelung des Fettstoffwechsels und somit auch bei der Entstehung verschiedener Erkrankungen, insbesondere von Atherosklerose und koronaren Herzerkrankungen. Es existieren Regulationsmechanismen, über welche Lipoproteine mittels ihrer spezifischen Strukturmerkmale von Zellen erkannt und aufgenommen werden. Die molekularen Details dieser Vorgänge sind noch weitgehend unbekannt, da der Molekülbau der entsprechenden Apolipoproteine, die als Träger der Erkennungsmechanismen fungieren, noch nicht aufgeklärt werden konnte. Die Kenntnis dieser molekularen Strukturen wäre aber von großem Interesse für zukünftige pharmazeutische Entwicklungen zur präventiven und therapeutischen Behandlung von Atherosklerose. Gegenstand dieses Projektes ist die strukturelle Aufklärung der Domänenstruktur von lipidfreiem Apolipoprotein B100 (Apo-B100), der einzigen Proteinkomponente des Low Density Lipoproteins (LDL), dem wichtigsten Cholesterinträger im Blut; weiters von definierten Spaltprodukten des Apo-B100, und schließlich des Hühner- Apolipoproteins apo-VLDL-II, welches als effektivster endogener Inhibitor für das Enzym Lipoproteinlipase bekannt ist. Bezüglich Apo-B100 sollen neue Wege der Solubilisierung und Stabilisierung durch detergensähnliche Polymere oder lipidähnliche Peptide erforscht werden. Dies geschieht entweder durch direkte Solubilisierung aus nativen LDL-Teilchen oder durch Detergensaustausch. Während natürlich vorkommende Spaltprodukte des Apo- B100 entweder durch spezifische enzymatische in vitro Spaltung oder durch Isolierung von in vivo im Eidotter gebildeten Apo-B100-Fragmenten erhalten werden, kann das apo-VLDL-II, aus der VLDL Komponente des Serums isoliert und gereinigt werden. Um atomare Proteinstrukturen röntgenkristallographisch aufzuklären, ist es unabdingbar, hoch geordnete Einkristalle zu züchten, wobei die Solubilisierung und Kristallzüchtung von membrangebundenen Proteinen nach wie vor eine große technische Herausforderung darstellen. Die nötigen Voraussetzungen zur Durchführung sind bereits gegeben. Weiters sehen wir einen großen Vorteil in der Verwendung eines Kristallisationsroboters, der reproduzierbare Ansätze kleinster Proteinmengen ermöglicht und so ein effizientes, weitläufiges Screening von Kristallisationsbedingungen ermöglicht. Zusätzlich werden biochemische und komplementäre biophysikalische Methoden, wie UV/VIS, Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie, sowie Röntgenkleinwinkelstreuung zur Charakterisierung der entsprechenden Apolipoproteinkomponenten herangezogen. Das Projekt wird auf nationaler Ebene durch Zusammenarbeit zweier Institutionen in Graz und Wien durchgeführt.

Im Rahmen des vorliegenden Projektes ist es uns gelungen, neue strukturelle und dynamische Besonderheiten von pro-atherogenen Plasmalipoproteinen zu entdecken und zu differenzieren. Plasmalipoproteine spielen Schlüsselrollen in der Regelung des Fettstoffwechsels und somit bei der Entstehung von Atherosklerose und koronaren Herzerkrankungen, die zu den häufigsten Todesursachen weltweit zählen. Die molekularen Details und spezifischen Strukturmerkmale von Lipoproteinen sind noch weitgehend unbekannt, sind aber für zukünftige pharmazeutische Entwicklungen zur präventiven und therapeutischen Behandlung von Dyslipidämien und Atherosklerose von großem Interesse. Im Laufe des Projekts haben wir Strukturmerkmale des kleinen dimeren Proteins ApoVLDL- II, das als effektivster endogener Inhibitor der Lipoproteinlipase in fettreichen Lipoproteinen fungiert, bestimmt. Wir konnten auch zeigen, dass Lipidphasenübergänge im Kern von Lipoproteinen so schnell vor sich gehen, dass sie auf geringfügige Temperaturunterschiede reagieren können. Wir fanden, dass Lipoproteinteilchen an sich hochdynamische Strukturen mit ausgeprägter Weichheit und Elastizität sind. Zusätzlich haben wir deutliche Hinweise erhalten, dass das funktionsbestimmende Protein, das Apolipoprotein B100 (apo-B100), unterschiedliche Beweglichkeiten aufweist, abhängig vom Lipoproteinteilchen an das es gebunden ist. Um diese molekularen Proteincharakteristika besser zu verstehen, haben wir unsere Versuche, die dreidimensionale Domänstruktur von apo-B100 zu studieren, intensiviert. Da klassische Detergentien die Struktur des Proteins nicht effizient genug stabilisieren, haben wir eine alternative Strategie gewählt und lipidähnliche Peptide als neue Klasse von oberflächenaktiven Substanzen herangezogen. Diese Designer-Peptide stabilisieren membranständige Proteine nach Delipidierung durch Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen. Entsprechend ihres amphipathischen Charakters selbstassemblieren die Peptide bei höheren Konzentrationen und bilden technologisch relevante Nanostrukturen aus. So waren wir die ersten, die eine doppelhelikale Peptidstruktur sichtbar machen konnten. Aufgrund dieser besonderen Eigenschaften zeigten nur wenige Peptidsequenzen ausreichend hohe Membranaktivität, um die Lipidorganisation in Lipoproteinen maßgeblich zu beeinflussen. Zu guter Letzt konnten wir jedoch ein Peptid identifizieren, das für die Kristallisation von apo-B100 herangezogen werden kann. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass wir einzigartige dynamische Eigenschaften von Lipoproteinen entdeckt haben, die als bestimmende Parameter für die Lipolyse und die Atherogenität von Lipoproteinteilchen in Frage kommen.