MicroRNAs im genregulatorischen Netzwerk von EWS-FLI1 im Ewing´s Sarkom

Dieses Projekt soll Mechanismen und Angriffspunkte der Genregulation durch EWS-FLI1 modulierte microRNAs (miRNAs) in Ewing Sarkomen (ESFT) untersuchen. Es baut auf ausgedehnt bestehenden genomischen mRNA und miRNA Daten auf und wird modernste Technologien der miRNA Forschung zur Anwendung bringen, um seine Ziele zu erreichen. EWS-FLI1 ist ein chimärer Transkriptionsfaktor, welcher von ESFT als Ergebnis einer chromosomalen Umlagerung gebildet wird. Es besteht hinreichende experimentelle Evidenz dafür, dass EWS-FLI1 für die Pathogenese dieser äußerst aggressiven Krebserkrankung verantwortlich ist, welche von einem den mesenchymalen Stammzellen (MSC) eng verwandten Gewebe ausgeht. Bisher konnten wir zeigen, dass die Bindung von EWS- FLI1 an proximale Genpromoter vor allem zu transkriptioneller Genaktivierung führt, während distale Bindung vornehmlich mit einem Silencer Effekt verbunden ist. Die Mehrzahl EWS-FLI1 aktivierter Gene kann Proliferationsfunktionen zugeordnet werden, während EWS-FLI1 reprimierte Gene eine Rolle in der Zellkommunikation, Differenzierung und Entwicklung spielen. Da die Mechanismen der Genrepression durch EWS-FLI1 weitestgehend unbekannt sind, haben wir kürzlich die mögliche Involvierung von miRNAs in die EWS- FLI1 vermittelte Modulation von Genen mit fehlender Promoterbindung zu untersuchen begonnen. Um die Rolle von EWS-FLI1 regulierten miRNAs in der Pathogenes von ESFT zu studieren, wurde genomweit nach miRNAs gesucht, deren Expression durch RNA-Interferenz vermittelte Modulation von EWS-FLI1 in 5 ESFT Zelllinien verändert ist, und die gleichzeitig von primären Tumoren und MSC differentiell exprimiert werden. Die so ermittelte miRNA Signatur beinhaltet gleichermaßen aktivierte und reprimierte miRNAs. Die in silico Target- Vorhersage weist für EWS-FLI1 aktivierte miRNAs eine Rolle in der Steuerung des Zellzyklus, jedoch für EWS- FLI1 reprimierte miRNAs in Entwicklung und Signaltransduktion aus. Interessanterweise zeigten nur 3 miRNAs der Signatur (hsa-mir-22*, hsa-mir-27*, und der hsa-mir-199/214 Cluster) eine EWS-FLI1 Promoterbindung. Daher ist für die Mehrzahl der EWS-FLI1 gesteuerten miRNAs der Mechanismus der Regulation unbekannt. In diesem Projekt werden wir i) auf der Basis ihrer Assoziation mit dem RISC Komplex in ESFT und MSC Gene identifizieren, die durch EWS-FLI1 regulierte miRNAs kontrolliert werden, ii) Kandidatengene validieren, die als Substrat von mehr als einer EWS-FLI1 regulierten miRNA vorhergesagt wurden, iii) vorhergesagte Target Gene für den miRNA Cluster hsa-mir-199/214 validieren, iv) die Mechanismen indirekter miRNA Regulation durch EWS-FLI1 erforschen. Die Ergebnisse dieses Projektes werden eine wichtige neue Ebene des Verständnisses krankhafter Genexpression in ESFT erschließen. Da miRNAs und ihre Regulation als vielversprechende diagnostische, prognostische und therapeutische Angriffspunkte gesehen werden, kann dieses Projekt helfen, neue therapeutische Optionen für ESFT zu erschließen.

In diesem Projekt entwickelten und validierten wir einen neuen paradigmatischen Ansatz zur unvorhergenommenen experimentellen Identifikation von mikroRNA regulierten Genen am Beispiel des Ewing Sarkoms. MikroRNAs (miRs) sind kleine (gewöhnlich 21-23 Nukleotide lange) nicht-kodierende RNA Moleküle, welche eine wichtige Rolle in der Genregulation spielen. Sie fungieren gewöhnlich als Modulatoren der Genexpression. Basierend auf teilweiser Sequenz Komplementarität zu sogenannten Seed Sequenzen im 3untranslatierten Bereich von Boten RNAs (mRNA), führen sie den RNA induced silencing complex (RISC) an ihre Ziel mRNAs heran und führen zum Abbruch der Eiweiß Synthese und zum Abbau der Ziel mRNA. Die Identifikation von Zielgenen für definierte miRs in einem spezifischen zellulären Kontext stellt immer noch ein wesentliches Problem dar. Eine spezifische miR erkennt viele verschiedene mRNAs, welche alle um deren Bindung im Wettbewerb stehen. Zusätzlich enthalten die meisten mRNAs Zielsequenzen für mehrere verschiedene miRs. Weiters hängen miR/mRNA Interaktionen von mehreren physikalischen Parametern ab, welche alle zusammen die verlässliche Vorhersage von miR regulierten Genen erschweren. In diesem Projekt entwickelten und validierten wir einen neuen Ansatz zur Genom-weiten Identifikation von miR Zielgenen, indem wir Hochdurchsatz-Screening von mit dem RISC assoziierten mRNA/miR Komplexen mit RNA Expressionsanalyse mittels Hochdurchsatz- Sequenzierung nach Depletion von spezifischen miRs kombinierten. Auf diese Weise konnten wir erfolgreich die Gesamtheit aller miR-assoziierten mRNAs in einer Ewing Sarkom Modellzelllinie definieren. Im Einklang mit unserer Beobachtung, dass in diesem Tumor miRs des hsa-miR-17-92 Clusters vom Ewing Sarkom Onkogen EWS-FLI1 am stärksten hochreguliert sind, beschreiben wir eine signifikante Anreicherung von Seed Sequenzen für diese miR Familie in den miR-gebundenen mRNAs. Mit unserer Methode entdeckten wir für diese miR Familie 7 bekannte und 80 bisher unbeschriebene Zielgene. Mutationsanalyse der Seed Sequenzen und Reporter Assays für eine Auswahl dieser Gene validierten unsere Ergebnisse erfolgreich und demonstrierten, dass unser experimenteller Ansatz herkömmlichen in silico Vorhersagealgorithmen überlegen ist. Schließlich fanden wir, dass etwa ein Viertel aller hsa-miR-17-92 Zielgene Komponenten der TGFB und BMP Signaltransduktionswege sind. Damit identifizierte unser Projekt eine wichtige Rolle des EWS-FLI1 regulierten hsa-miR-17-92 Clusters in der Modulation mesenchymaler Differenzierung und der Re-Programmierung von entwicklungsspezifischen Signal Kaskaden.