Biophotonische Analyse der T-Zell-Erkennung

Die Antigenerkennung durch T-Zellen nimmt eine zentrale Stellung in der adaptiven Immunität ein und ist essentiell in der Neutralisierung von Pathogenen. Allerdings ist sie auch eine Voraussetzung für die Entstehung von Allergien und Autoimmunität. T-Zellen stehen daher seit mindestens 30 Jahren im Fokus der medizinischen Grundlagenforschung. Trotzdem können wir ihre hohe Sensitivität gegenüber Antigenen, welche von fundamentaler Bedeutung für ihre Funktion ist, nicht erklären. Die größte Schwierigkeit, dieses Thema experimentell anzugehen, besteht darin, dass T-Zell-Antigen Erkennung in der Kontaktoberfläche zwischen T- Zellen und ihren konjugierten Antigen Präsentierenden Zellen (APC), der sogenannten Immunologische Synapse, stattfindet. Hier binden T-Zell Rezeptoren (TCR) ihre nominalen Antigene, d.h. im Komplex mit MHC Molekülen (pMHC) befindliche antigene Peptide unter den besonderen geometrischen Bedingungen zwei sich gegenüberliegender beweglicher Membranen und lösen daraufhin T-Zell-aktivierende Signalkaskaden aus. Konventionelle biochemische Ansätze geben hier wenig Aufschluß über die molekulare Dynamik der Antigenerkennung, weil sie eine membranfreie Umgebung voraussetzen und damit den speziellen molekularen Kontext innerhalb der Immunsynapse ignorieren. Wir haben daher innovative Mikroskopie-Ansätze entwickelt, mit welcher wir die molekulare Dynamik der T-Zell Antigen Erkennung in der Synapse lebender T-Zellen quantitativ erschließen. Wir konfrontieren T-Zellen mit funktionalisierten planaren Glass-unterstützten Lipiddoppelschichten (Bilayern), welche als APC-Ersatz dienen. Wir können TCR-pMHC Wechselwirkungen unter diesen Umständen mittels Einzelmolekülmikroskopie und Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Mikroskopie in situ messen. Außerdem erlaubt uns dieses System, die Verteilung von Schlüsselproteinen in der T-Zell-Synapse mittels Photoactivation Localization Microscopy (PALM), einem auf Einzelmolekülmikroskopie basierten Darstellungsverfahren mit einer Auflösung von bis zu 10 nm (d.h. unterhalb der Difraktionsgrenze des sichtbaren Lichts) zu visualisieren. Wir möchten nun diese erfolgreiche Experimentenreihe fortsetzen, um T-Zell-intrinsische Faktoren zu identifizieren, welche die T-Zell-Sensitivität gegenüber Antigen maßgeblich beeinflussen. Unser besonderes Interesse gilt hierbei dem Einfluss der Zelladhäsion (Zielstellung 1), der Ko-Stimulation (Zielstellung 2) und Glykan-vernetzender Galektine (Zielstellung 3) auf die synaptische TCR-pMHC-Bindung, auf TCR-proximale Signaltransduktionswege wie auch auf die nanoskopische Verteilung von TCRs und Akzessorischen Molekülen in der Immusynapse. Weiterhin möchten wir das Auftreten homotypischer Interaktionen zwischen TCRs und zwischen pMHCs in situ analysieren und quantifizieren (Zielstellung 4), weil diese zur Bildung von TCR- Strukturen höherer Ordnung führen könnten und damit Kinetik der synaptischen TCR-pMHC Interaktion wie auch die einhergehende Signaltransduktion modulieren könnten. Ziel ist es außerdem herauszufinden, wie diese Faktoren die T-Zell-Sensitivität gegenüber Antigenen modulieren und wie sie selbst im Zuge der T-Zell-Differenzierung reguliert werden. Um schlussendlich zu testen, inwieweit die Bedeutung o.g. T-Zell-intrinsischer Faktoren für die Antigenerkennung im Rahmen der T-Zell-Entwicklung variiert, werden wir ihren Einfluss auf die Kinetik von TCR-pMHC-Interaktionen sowie einhergehender Signalprozesse in Synapsen von Thymozyten, naven T-Zellen, T-Effektor- und T-Gedächtniszellen vergleichen.

T-Zell Antigenerkennung ist ein wichtiger Vorgang im Rahmen der Immunantwort gegen Krankheitserreger. Jüngste Erfolge in der Entwicklung effektiver T-Zell-basierter Immunkrebstherapien verdeutlichen überdies das enorme klinische Potential, welches vom Prozess der T-Zell Antigenerkennung ausgeht. Allerdings sind zugrundeliegende Mechanismen trotz langjähriger intensiver Forschung immer noch nicht umfassend geklärt. Zellulär beruht dieser Prozess auf der Bildung einer Immunologischen Synapse (IS), des Kontaktes zwischen T-Zelle und Antigen-präsentierenden Zelle (APC). Hier geben molekulare Interaktionen zwischen T-Zell Antigen Rezeptoren (TCRs) und von APCs prozessierten Antigenfragmenten, welche mittels MHC Molekülen gezeigt werden, den Ausschlag über Zellaktivierung oder Bewahrung des Ruhezustands. T-Zellen sind gegenüber diesen Peptid-MHC Komplexen (pMHCs) überaus sensitiv: sie können die Gegenwart von einzelnen antigenen pMHCs aufspüren, obwohl diese eigentlich nur eine geringe Affinität zu TCRs aufweisen und gegenüber den strukturell sehr ähnlichen aber nicht-stimulierenden endogenen pMHCs massiv in der Unterzahl vorliegen. Wie können wir nun auf dieser Grundlage die bemerkenswerte Effizienz der T-Zell Erkennung erklären? Als von entscheidender Bedeutung betrachten wir hier die die stark veränderte Bindungsdynamik innerhalb der IS aufgrund der begünstigenden Anordnung der Bindungspartner einerseits und andererseits der gleichzeitig stattfindenden Interaktionen Zelladhäsions-vermittelnder Rezeptoren. Um diese Faktoren in unsere Analyse miteinzuschließen, haben wir hochauflösende Mikroskopie-Verfahren entwickelt, mittels welcher wir TCR-pMHC Bindungen innerhalb der IS messen können. Auf diese Weise gelang es uns, die entscheidende Rolle der von ICAM-1 vermittelten Zelladhäsion für T-Zell Antigenerkennung zu zeigen. Wir untersuchen gegenwärtig, in welchem Maß TCR:pMHC -Assoziation und -Dissoziation von der LFA-1:ICAM-1 Bindung betroffen sind. Zu unserer Überraschung entdeckten wir, dass T-Zellen, welche für die Klinik mit hochaffinen Tumor- spezifischen Chimären Antigen Rezeptoren modifiziert worden sind (CAR-T-Zellen), um Krebszellen direkt zu attackieren, ICAM-1 benötigen, um geringe Mengen des Tumorantigens zu detektieren. Wir vermuten daher, dass sowohl die von LFA- 1:ICAM-1 vermittelte Adhäsion wie auch die einhergehende Zell-Signalweiterleitung entscheidend für das Aufspüren geringster Antigenmengen sind. Zudem konnten wir zeigen, dass monomere TCRs und monomere pMHCs die für die T-Zell Antigenerkennung maßgebende molekularen Spezies sind. Weder die Gegenwart noch die Entstehung von TCR- und pMHC-Strukturen höherer Ordnung waren in unseren Untersuchungen für den Prozess der T-Zell Antigen Erkennung relevant. Gegenwärtig klären wir den Einfluss schwach-bindender sogenannter ko- agonistischer pMHCs auf die TCR-Binding von seltenen stimulierenden pMHCs. Zusammengenommen leisten unsere Ergebnisse einen wichtigen Beitrag, die Besonderheiten der T-Zell Antigenerkennung mechanistisch auf zellulärer wie molekularer Ebene zu verstehen. Dieses Wissen legt die Grundlage für die Optimierung von bereits existierenden und zur Entwicklung neuartiger T-Zell basierter Therapien im Kampf gegen Krebs, Autoimmunität und Allergien.