Reguliertes alternatives Spleißen bei DNA Schädigung

Erst in den letzten Jahren gab es neue bedeutende Erkenntnisse, dass die Genexpression durch post- transkriptionelle Prozesse reguliert werden kann und dass dies eine wichtige zusätzliche Ebene der Genregulation darstellt. Die Information der Gene ist in Genabschnitten (Exons) gespeichert, die durch dazwischen liegende Gensequenzen (Introns) unterbrochen werden. Um Transkripte mit sinnvoller Information für die Proteinproduktion zu bekommen, müssen die Introns entfernt werden und die Exons aneinander gespleißt werden. Diese Exons können nun durch unterschiedliche Kombinationen des Spleißen verschiedene Trankripte (mRNAs) ergeben, die entweder für unterschiedliche Proteine kodieren oder durch ihre unterschiedliche Stabilität die Genexpression beeinflussen. Dieses differentielle Spleißen wird durch hoch konservierte Spleißfaktoren, wie die SR Proteine (Serine-Argenin reiche Proteine) reguliert und ist sowohl abhängig vom Zelltyp als auch von Umweltsfaktoren. In Arabidopsis haben wir erst kürzlich gezeigt, dass sicher mehr als 60% der Gene die Introns enthalten durch alternatives Spleißen reguliert werden können und einige der Arabidopsis SR Proteine an der Regulation verschiedener Stoffwechselwege und Stressreaktionen beteiligt sind. Sowohl Umwelt-Stress als auch endogene Vorgänge in der Zelle können zu DNA Schäden führen, die durch eng koordinierte Prozesse wieder repariert werden müssen. Diese Reparaturprozesse sind bei Pflanzen und Tieren hauptsächlich auf der Ebene der Transkriptionskontrolle, der Signalwege und in letzter Zeit auch epigenetisch untersucht worden, aber überraschenderweise konnte auch kürzlich gezeigt werden, dass hier Spleißfaktoren und auch alternatives Spleißen eine Rolle spielen. Obwohl DNA Schädigung und die dadurch induzierte DNA Reparatur in Pflanzen gut untersucht sind, ist über ihre Regulierung durch alternatives Spleißen nicht sehr viel geforscht worden. Dieses Projekt widmet sich dem Zusammenhang von DNA Schädigung, der dadurch induzierten Reparaturwege und der Regulation der notwendigen Gene durch alternatives Spleißen. Im Speziellen wollen wir genomweit den Einfluss von DNA Schäden auf die Transkription und alternatives Spleißen analysieren. Da bei diesem Prozess pflanzenspezifische SR Proteine eine Rolle spielen, werden wir genomweit die RNA Transkripte identifizieren, an die sich diese SR Proteine binden. Dies sollte uns in die Lage versetzen, ein RNA Bindungsmotif für die SR Proteine zu finden. Um die Evolution dieser Regulationwege durch SR Proteinen zu studieren, werden wir auch im kleinen Maßstab Experimente mit dem Moos Physcomitrella patens durchführen. Dieses Projekt wird wesentliche Erkenntnisse über die post-transkriptionelle Regulation der DNA Reparatur nach genotoxischem Stress liefern und auch aufzeigen, wie DNA Schäden die Transkription und alternatives Spleißen beeinflussen.

Seit die Pflanzen das Land erobert haben, haben sie sich als sessile Organismen an eine Vielzahl unterschiedlicher Umgebungen anpassen müssen. Sowohl in der Natur als auch in landwirtschaftlich geprägten Umgebungen gibt es viele verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren, die zu DNA-Schäden führen können. Zusätzlich zum Umweltstress gibt es auch verschiedene zelluläre Prozesse, die die Integrität der DNA gefährden können. Es ist daher wichtig zu verstehen, welche Strategien Pflanzen zur Erkennung und Reparatur von DNA-Schäden entwickelt haben. Alternatives Spleißen, ein Prozess, der es einem Gen ermöglicht, mehr als eine Proteinvariante zu produzieren, und der auch die Proteinhäufigkeit und -verfügbarkeit beeinflusst, ist ein wichtiger Akteur der Regulation der Genexpression. Neuere Studien, einschließlich unserer, haben gezeigt, dass die meisten Pflanzengene alternativ gespleißt werden, was die Bedeutung des alternativen Spleißens für die Pflanzenentwicklung und die Stressreaktion unterstreicht. Um unser Wissen über alternatives Spleißen in Pflanzen weiter zu vertiefen, haben wir Methoden für den verbesserten Nachweis und die Quantifizierung der mRNA Transkripte entwickelt. Wir konnten zeigen, dass ~ 34.000 Gene der Modellpflanze Arabidopsis thaliana mehr als 82.000 RNA-Varianten produzieren. Interessanterweise haben wir bisher unentdeckte alternative Spleißereignisse entdeckt, die wir als Exitron-Spleißen bezeichneten. Exitron- Spleißen erhöht die Anzahl der von einem einzelnen Gen produzierten Proteinvarianten und beeinflusst die Proteinfunktion. Mindestens 6,6% der Arabidopsis und 3,7% der menschlichen Protein-kodierenden Gene enthalten Exitrons. Exitron-Spleißen passiert in vielen essentiellen pflanzlichen und menschlichen Genen, einschließlich solchen, die an Stressreaktionen, der Reparatur von DNA-Schäden und Krebs beteiligt sind. Wir konnten sowohl mehrere Arabidopsis-Gene identifizieren, die ihr alternatives Spleißen als Reaktion auf DNA-Schäden ändern, als auch Regulatoren isolieren, die diese Änderungen steuern. Dabei konzentrierten wir uns auf die Regulatoren, die sich pflanzenspezifisch entwickelt haben. Interessanterweise konnten wir zeigen, dass sie selbst als Reaktion auf Stress und DNA-Schäden reguliert werden, und diese Regulation hängt von den Lichtverhältnissen ab. Dieses Regulationsnetzwerk ist bei Arabidopsis und dem Moos Physcomitrella patens evolutionär erhalten geblieben, obwohl diese Arten schon mehr als 400 Mio. Jahren getrennt sind. Durch eine weitere Mutationsanalyse dieser Spleißregulatoren unter verschiedenen Wachstumsbedingungen haben wir hochkonservierte Expressionsmodule identifiziert, die die Genexpression als Reaktion auf Hell/Dunkel und DNA-Schäden steuert. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung des alternativen Spleißens bei der Regulation der Genexpression während des Pflanzenwachstums und der Stressreaktion.