Die Rolle von RKIP in myeloischer Leukämogenese

Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine aggressive hämatologische Neoplasie, die durch maligne Transformation hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) verursacht wird. Eine konstitutive Aktivierung des RAS-mitogen activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase (MAPK/ERK) Moduls ist ursächlich an der onkogenen Transformation beteiligt und häufig bei AML zu beobachten. In eigenen Vorarbeiten konnten wir beobachten, dass ein Verlust des RAF kinase inhibitor protein (RKIP) bei über 20% aller AML Patienten vorkommt und darüber hinaus mit RAS Mutationen koexistiert. In in-vitro Analysen konnten wir zeigen, dass die ektope Überexpression von RKIP sowohl die RAS-MAPK/ERK Signaltransduktion, als auch die RAS-induzierte maligne Transformation inhibierte. Weitere, preliminäre Ergebnisse deuten darüber hinaus auf eine ursächliche Rolle von deregulierter microRNA Expression in der Entstehung des RKIP Verlusts hin. Basierend auf diesen Daten werden wir im beantragten Projekt die folgenden zwei Hypothesen testen: i) RKIP ist ein essentieller Modulator des RAS-MAPK/ERK Pfades im myeloischen, hämatopoetischen System und sein Verlust verstärkt die RAS-induzierte myeloische Leukämogenese. ii) RKIP Verlust in AML wird durch aberrante microRNA Expression verursacht. In einer ersten Projektphase werden wir die Auswirkungen von RKIP Verlust auf die RAS-MAPK/ERK Signaltransduktion sowie auf Proliferation und Selbsterneuerung von HSPC in Mäusen mit einem kompletten knockout von RKIP (RKIP-/-) untersuchen. Wir werden dabei HSPC von RKIP-/- Tieren isolieren und auf den Aktivierungsstatus des RAS-MAPK/ERK Moduls untersuchen. In weiterer Folge werden wir ihre Kapazität zur Proliferation und Selbsterneuerung in sogenannten colony-forming Experimenten und Transplantationsmodellen determinieren. In einer zweiten Projektphase werden wir RKIP-/- Mäuse mit Tieren, die eine im Knochenmark induzierbare onkogene KRAS Mutation (Mx1-Cre KRASG12D) tragen, kreuzen, wodurch wir die Rolle von RKIP in der RAS-induzierten myeloischen Leukämogenese untersuchen können. Die KRAS Mutation verursacht die Entstehung einer myeloproliferativen Neoplasie mit einer Penetranz von 100%, jedoch sind sekundäre genetische Ereignisse nötig, um die Transformation in eine AML zu ermöglichen. Wir werden dabei anfänglich abklären, ob RKIP Verlust in verkürztem Überleben und/oder AML Transformation in diesen Mäusen resultiert. Danach werden wir transformierte myeloische Zellen zur Charakterisierung der RAS- MAPK/ERK Signaltransdukion, Proliferation und Selbsterneuerung mittels Durchflusszytometrie, colony-forming Experimenten und Transplantationsmodellen heranziehen. In einer abschliessenden Projektphase werden wir die Rolle von aberranter microRNA Expression bei der Entwicklung des RKIP Verlusts in der AML abklären. Dazu werden wir fünf Kandidaten-microRNAs, die wir über eine microRNA chip Analyse in AML Patientenmaterial identifizieren konnten, in funktionellen in-vitro Studien in einer Auswahl an AML Zelllinien testen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die in diesem Proejkt gewonnenen Resultate eine Aufklärung der Ursachen und Auswirkungen von RKIP Verlust in der physiologischer Hämatopoese und myeloischer Leukämogenese ermöglichen werden. Dies kann in weiterer Folge zur Entwicklung gezielter Therapieansätze führen.

Akute myeloische Leukämie (AML) ist ein aggressiver Tumor des blutbildenden (oder hämatopoetischen) Systems, der durch eine bösartige Umwandlung von hämatopoetischen Stamm- und Progenitorenzellen (HSPZs) verursacht wird. Unter anderem sind dafür Veränderungen in zellulären Signaltransduktionswegen verantwortlich. Diese sind normalerweise für die Regulation von essentiellen zellulären Funktionen wie Wachstum und Teilung zuständig. RAF kinase inhibitor protein (RKIP) ist ein Inhibitor von zellulärer Signaltransduktion. Unsere Gruppe hat in einem vorherigen Projekt gezeigt, dass ein RKIP Verlust häufig bei AML PatientInnen zu finden ist. Im hier zusammengefassten Projekt haben wir nun versucht, diesen RKIP Verlust bei AML noch genauer abzuklären. Dafür haben wir eine Reihe von humanen PatientInnenproben analysiert, und Experimente in AML Zelllinien und Mäusen mit und ohne künstliche RKIP Inaktivierung durchgeführt. Wir konnten dabei zeigen, dass RKIP Verlust tatsächlich von Relevanz für die Leukämieentstehung ist: einerseits, weil es die leukämischen Charakteristika von AML Zelllinien verstärkt, andererseits aber auch, weil es die Leukämieentstehung in Mäusen verschlimmert. Dies wird laut unseren Daten vermutlich durch eine gesteigerte Aktivierung von zellulärer Signaltransduktion ausgelöst, was sowohl das Wachstum als auch die gestörte Differenzierung von HSPZs nach sich zieht. Interessanterweise beobachteten wir, dass RKIP Verlust zwar die Leukämieentstehung zusammen mit zusätzlichen pathologischen Aberrationen der Signaltransduktion verstärkte, dass aber RKIP Verlust als alleinige genetische Veränderung nicht genug war um eine Leukämie auszulösen. Das legt den Schluss nahe, dass RKIP Verlust nicht als Auslöser, sondern eher als Amplifikator der Leukämieentstehung zu wirken scheint. Dies bestätigte sich auch in den PatientInnenproben: tatsächlich kam RKIP Verlust im Normalfall nicht alleine, sondern zusammen mit anderen Signaltransduktionveränderungen vor. Im zweiten Teil des Projekts beschäftigten wir uns mit den Ursachen des RKIP Verlusts bei AML. Dabei entdeckten wir, dass RKIP Verlust durch die Überexpression einer spezifischen mikro-RNA (miR-23a) verursacht wird. Mikro-RNAs sind RNA Fragmente, die für kein Gen bzw. Protein kodieren und daher lange als zellulärer Schrott gesehen wurden. Mittlerweile ist jedoch bekannt, dass mikro-RNAs zentrale Regulatoren von Genexpressionsprofilen sind. In diesem Projekt zeigen wir nun, dass miR- 23a an RKIP bindet und damit einen RKIP Verlust verursacht. Dazu passend konnten wir durch Überexpression von miR-23a die gleichen leukämischen Effekte wie durch RKIP Verlust auslösen. Ebenso beobachteten wir bei AML PatientInnen mit erniedrigter RKIP Expression auch eine erhöhte Expression der miR-23a. Zusammenfassend zeigt unser Projekt, dass RKIP für die Entstehung von myeloischen Leukämien relevant ist und identifiziert die erhöhte Expression von miR-23a als Ursache von RKIP Verlust bei AML. Diese Daten werden helfen, neue Therapiestrategien für PatientInnen mit myeloischen Leukämien zu entwickeln.