Aufklärung der spezifischen Zytotoxizität von Dimethylacrylshikonin in Melanomzellen

Trotz intensiver Forschungen in den letzten Jahrzehnten ist Krebs noch immer die zweithäufigste Todesursache in den meisten entwickelten Ländern und eine zunehmende Todesursache in Entwicklungsländern. Die Inzidenz des malignen Melanoms steigt schneller als jede andere Art solider Tumoren, und obwohl nur 4% aller Hautkrebserkrankungen maligne Melanome sind, sind sie doch für 79% aller Todesfälle verantwortlich. Vor allem in einem fortgeschrittenen Stadium ist das Melanom immer noch eine der aggressivsten und unheilbarsten Arten von Krebs. Daher sind Verbesserungen im Verständnis der Melanombiologie und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien wichtige Forschungsziele. Heute sind etwa 79% aller zugelassenen Krebsmedikamente Naturstoffe oder von Naturstoffen abgeleitet. In einem vorausgegangenen, FWF geförderten Projekt (P21114) haben sich Inhaltsstoffe der Wurzeln von Onosma paniculata Bur.&Franch. (Boraginaceae) als sehr interessante Substanzen herauskristallisiert. Vor allem Dimethylacrylshikonin (DMAS) zeigt vielversprechende Wirkungen in Melanomzelllinien unterschiedlicher Progression. Es gibt Hinweise, dass DMAS Moleküle beeinflusst, die bei der Apoptose, dem Zellwachstum, der Proliferation und dem Überleben der Zelle eine wichtige Rolle spielen, was von großem Interesse bei der Aufklärung neuer Wirkmechanismen ist. Aufgrund unserer und anderer Ergebnisse gehen wir davon aus, dass DMASunterschiedliche molekulare Targets in Melanomzelllinien mit unterschiedlichem Mutationsstatus und Progression hat. Daher werden wir verschiedene Melanomzelllinien mit diesen Charakteristika verwenden und Unterschiede in der Induktion des Zelltodes aufdecken. Dafür bedienen wir uns funktioneller Assays, die Apoptose, Nekrose, Seneszenz und Autophagie abdecken. Zusätzlich werden wir mit vier Zelllinien Microarray Versuche durchführen, um Pathways und Gene aufzuspüren, die auf DMAS ansprechen. Wir erwarten, dass klassische Pathways (z.B. Aktivierung von Caspasen und der MEK-ERK Pathway) durch DMAS beeinflusst werden, aber auch welche, die bisher nicht bekannt sind. Diese Daten werden mittels RT-qPCR verifiziert werden und in allen anderen Zelllinien auch untersucht werden. Zusätzlich werden die Pathwayanalysen mit Hilfe von Gen- Überexpressionen/-Stilllegungen und/oder Ant-/Agonisten zentraler Enzyme weiter vertieft. Von einem bereits durchgeführten Microarray Experiment wissen wir, dass DMAS die DHFR (Dihydrofolat- Reduktase), p62 (Sequestosom 1), RNF181 (Ringfinger Protein 181), PSMB2 (Proteasom Einheit) und PSMC4 (Proteasom Einheit) beeinflusst. Diese Effekte werden im Rahmen dieses Projektes noch näher untersucht. Zu guter Letzt, werden wir die Struktur von DMAS modifizieren, um noch aktivere Derivate zu erhalten und die Wirkung von DMAS auch in vivo studieren.. Zusammenfassend wird diese Studie neue Einblicke in die Wirkmechanismen von DMAS und dessen Derivaten ermöglichen und zu der notwendigen Suche nach neuen Targets in der Melanomtherapie beitragen.

Das maligne Melanom (schwarzer Hautkrebs) ist die tödlichste Hautkrebsart und verantwortlich für über 75 % aller Todesfälle bei Hautkrebs. Die Zahl der Neuerkrankungen steigt weltweit rapide an. Es gibt derzeit nur sehr eingeschränkte Therapiemöglichkeiten, und bei besonderen Formen des schwarzen Hautkrebses (NRAS Mutation oder metastasiertes malignes Melanom) gibt es kaum wirkungsvolle Medikamente. Daher hat die Entwicklung neuer Medikamente gegen diese Krankheit sehr große Bedeutung. Im Vorfeld wurde ein breites Screening traditionell verwendeter chinesischer Arzneidrogen durchgeführt und nur mit den effektivsten weitergearbeitet um die Wirkstoffe zu isolieren. Im vorliegenden FWF Projekt haben wir eine der isolierten wirksamen Substanzen, ß-ß- Dimethylacrylshikonin (DMAS), sehr erfolgreich auf verschiedene Melanom-Zelllinien getestet. DMAS wurde aus den Wurzeln von Onosma paniculatum Bur. & Franch. (Boraginaceae) isoliert und die Wirkung auf verschiedene Melanom-Zelllinien mit unterschiedlichen Assays analysiert. Zunächst wurden die IC50 Werte bestimmt. Sie lagen immer in einem sehr niedrigen Konzentrationsbereich. DMAS induzierte in den Krebszellen sowohl Apoptose (kontrollierter Zelltod) als auch Nekrose (unkontrollierter Zelltod). Detailliertere Untersuchungen wurden mittels Genexpressions-Analysen gemacht. Die Apoptose wurde mit unterschiedlichen Experimenten verifiziert und es kristallisierte sich ein Gen (NOXA) heraus, das eine zentrale Rolle bei der Wirkung spielt. Auch in-vivo Untersuchungen zeigten, dass DMAS sehr effizient wirkt und die Umgebungszellen kaum angriffen werden. Viele Krebstherapeutika haben ihren Ursprung im Pflanzenreich, kommen aber nur in sehr geringen Konzentrationen natürlich vor. Im Falle von DMAS ist es sehr vorteilhaft, dass die Wirksubstanz synthetisiert werden kann (womit sich natürliche Ressourcen schützen lassen). Weitere Vorteile sind, dass sie in geringen Dosen wirkt und dass sie in-vivo keine Nebeneffekte induziert. DMAS bietet somit eine innovative Möglichkeit für neue Therapieansätze zur Behandlung des schwer oder kaum behandelbaren Melanoms. Im Zuge dieses Projektes wurden außerdem 36 neue Shikonin-Derivate synthetisiert und untersucht. Dabei wurden zwei weitere, sehr interessante Derivate gefunden. Beide induzierten ebenfalls Apoptose, wobei die jeweiligen IC50 Konzentrationen deutlich unter der von DMAS lagen. Abschließend konnten wir zeigen, dass DMAS enthaltende Pflanzen oftmals falsch deklariert in den Handel gelangen, weil die Wurzeln sehr ähnlich aussehen und ähnliche Inhaltsstoffe enthalten. Mit Hilfe eines chromatographischen Verfahrens (HPTLC) ist es uns gelungen, eine Methode zu entwickeln, diese Arten zu unterscheiden und eine wichtige Markersubstanz zu identifizieren.