Struktur und Biologie von Multi-Domänen-Metallothioneinen

Gastropoden (Schnecken) sind eine sehr alte, seit dem Kambrium bekannte Tiergruppe mit hoher Stress- Resistenz und einer außerordentlichen Kapazität zur Entgiftung toxischer Schwermetalle, wie zum Beispiel Cadmium (Cd). Diese Fähigkeit beruht auf der spezifischen Bindung und Inaktivierung von Cd an sogenannte Metallothioneine (MTs). Das sind zumeist niedermolekulare, Schwermetall-bindende Proteine mit typischerweise zwei bis drei strukturellen Untereinheiten (Domänen), von denen jede neun Schwefelatome besitzt, über die jeweils drei zweiwertige Cd-Ionen gebunden werden können. Neueste Untersuchungen haben gezeigt, dass insbesondere moderne Gastropodenarten höhermolekulare Metallothioneine mit bis zu elf Cd- bindenden Domänen besitzen, die als Multi-Domänen-Metallothioneine (md-MTs) bezeichnet werden, und deren Entgiftungskapazität für das toxische Metall dadurch verfielfacht werden kann. Die Expression und Synthese dieser Proteine werden bei Anwesenheit von Cd in der Umwelt innerhalb kurzer Zeit induziert, wodurch der Entgiftungsvorgang noch einmal beschleunigt wird. Bei allen Gastropoden-MTs mit zwei oder drei Domänen unterscheidet sich die am C-Terminus des Proteins situierte Beta 2-Domäne von den restlichen, sogenannten Beta 1-Domänen durch ihre Eigenschaft, die Cd-Beladung durch das Protein zu initiieren und die Cd-Bindung dadurch zu verstärken. Es ist jedoch bislang unklar, ob und inwieweit dies auch für md-MTs gilt, und welche molekularen Mechanismen für diese Initiator-Funktion bei der Cd-Bindung verantwortlich sind. Im vorliegenden Projekt sollen daher bereits bekannte und neue md-MTs einiger Schneckenarten rekombinant exprimiert und gezielt verändert werden, indem die Beta 2-Domäne mit den Beta 1-Domänen vertauscht wird, um zu prüfen, wie sich diese Veränderungen auf die biologische Funktion dieser md-MT-Chimären auswirken. Zu diesem Zweck werden die natürlichen und die chimärisch veränderten md-MTs in Zellkulturen und in lebenden Essigälchen (Caenorhabditis elegans) transformiert, um deren Entgiftungs-Effizienz in unterschiedlichen biologischen Systemen zu überprüfen. Darüber hinaus sollen die Bindungs-Kapazität und die dreidimensionale Struktur dieser md-MTs mit Hilfe von massenspektroskopischen Methoden und mittels NMR (Nuklearmagnetische Resonanz-Spektroskopie) aufgeklärt werden. Wir versprechen uns von den Ergebnissen tiefgreifende Einblicke in die molekularen Mechanismen der Cadmium-Entgiftung und hoffen, dass dadurch das Verständnis für die Zusammenhänge zwischen Struktur und Entgiftungs-Funktion von MTs wesentlich vertieft werden kann. Die Untersuchungen im Rahmen des Projektes sollen von Dr. Reinhard Dallinger und Dr. Veronika Pedrini- Martha am Institut für Zoologie der Universität Innsbruck geleitet und koordiniert werden, wobei eine enge Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern in Innsbruck (Dr. Pidder Jansen-Dürr, Forschungs-Institut für Biomedizinische Alternsforschung), an der Universität Zürich (Dr. Oliver Zerbe, Institut für Biochemie) und an zwei Universitäten in Barcelona (Dr. Mercé Capdevila, Autonome Universität von Barcelona und Dr. Ricard Albalat, Universität von Barcelona) geplant ist.

Metallothioneine (MTs) sind in allen Tiergruppen verbreitete, Metall-bindende Proteine, die für die Entgiftung und homöostatische Regulierung physiologisch wichtiger Metalle, wie Kupfer (Cu), Zink (Zn) und Cadmium (Cd), verantwortlich sind. Wie wir in unseren bisherigen Arbeiten zeigen konnten, besitzen zahlreiche Vertreter der Gastropoden (Schnecken) aus dem Stamm der Weichtiere (Mollusken) Cd-spezifische MTs, die sich im Verlauf der Evolution in diesen Tieren entwickelt haben. Wie wir dank unserer Untersuchungen seit kurzem wissen, weisen einige dieser MTs eine sogenannte Multi-Domänen-Struktur auf, wobei sich eine oder mehrere der Metall-bindenden Domänen in repetitiver Weise vervielfältigt haben. Dadurch sind in manchen Schneckenarten, wie z.B. in der terrestrischen Schließmundschnecke Alinda biplicata (A.b.), MTs mit bis zu 10 Metall-bindenden Domänen entstanden. Man nennt diese Proteine daher Multi-Domänen-Metallothioneine (md-MTs). Im vorliegenden Projekt ging es um die Struktur, die Metallbindungs- Eigenschaften, sowie um die evolutionsbiologische und ökophysiologische Bedeutung von md-MTs in Vertretern von Gastropoden (Schnecken) aus terrestrischen, aquatischen und marinen Lebensräumen. Dabei sollten zunächst die Häufigkeit und genetische Variabilität von md-MTs innerhalb der Gastropoden erkundet werden. In einigen Schneckenarten wurde zudem die physiologische Funktion der md-MTs nach Metall- und Stressbelastung in vivo untersucht. Ausgehend davon wurden einige dieser md-MTs und deren mutierte Varianten mit veränderten Domänen-Sequenzen und mit reduzierter Domänen-Anzahl rekombinant exprimiert, um deren Struktur und Metallbindungs-Eigenschaften mittels spektrophotometrischer Methoden, Massenspektrometrie und NMR zu charakterisieren. md-MT-Konstrukte aus der Schneckenart A.b. wurden sodann in drei verschiedenen eukaryotischen Zellsystemen transfiziert bzw. exprimiert: Hefezellen, Maus-Fibroblasen und Nematoden der Art Caenorhabditis elegans (C.e.). Dabei sollte überprüft werden, ob und in welchem Maß die in diesen Systemen exprimierten md-MTs von A.b. (und deren Mutanten) tatsächlich auch zu einer erhöhten Metallresistenz führten. Die wichtigsten Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden. 1. md-MTs sind in Gastropoden weit verbreitet: Sie konnten sowohl in terrestrischen Arten, als auch in marinen Vertretern und Süßwasser-Arten nachgewiesen werden. 2. In allen untersuchten Fällen waren die Art-spezifischen md-MTs in ihrer Metallbindung hochgradig Cd-selektiv und dienten vorwiegend der Cd-Entgiftung. 3. Die Expression von nativen und mutierten md-MTs aus A.b. führte in allen eukaryotischen Zellsystemen und in C.e. zu einer erhöhten Cd-Resistenz nach entsprechender Belastung, bzw. sogar (bei C. e.) zu einer im Vergleich zum Wildtyp-Stamm erhöhten physiologischen Fitness. 4. Mittels NMR konnten die 3D-Struktur und die Dynamik der Metallbeladung an md-MTs von A.b. und einer Tiefseeschnecke (Chrysomallon squamiferum) (C.s.) aufgeklärt werden. Dabei zeigte sich, dass md-MTs keine globuläre Struktur aufweisen, sondern aus einer perlschnurartigen Aneinanderreihung Metall-bindender Domänen bestehen ("beads on string"). 5. Mittels Hochdruck-NMR konnte schließlich gezeigt werden, dass sich die 3-D-Struktur von md-MTs aus Tiefsee-Schnecken (C.s.) an die dort herrschenden erhöhten Druckbedingungen durch Einlagerung von Wassermolekülen und Beibehaltung ihrer für die Metallbindung wesentlichen Flexibilität anpassen konnten.