EWS-FLI1-Fluktuationen im Ewing-Sarkom

Für Patienten mit bösartigen soliden Tumoren ist die Entwicklung von Metastasen meist mit Therapieresistenz und einer schlechten Prognose verknüpft. Deshalb besteht ein Bedarf an neuen Medikamenten, welche die Entwicklung und Ausbreitung von Metastasen verhindern. Dies gilt auch für das Ewing Sarkom, einen bösartigen Knochentumor, welcher vor allem bei Jugendlichen auftritt. Grundlage der Metastasierung ist ein hohes Maß zellulärer Plastizität. Diese erlaubt es den Tumorzellen, ihr Zytoskelett so zu verändern, dass sie in das umliegende Gewebe einwachsen, in die Blutbahn eindringen, ferne Organe im Körper besiedeln, und sich dort vermehren. Das Wachstum des Ewing Sarkoms wird von einem onkogenen Fusionsprotein getrieben, welches als Folge einer Umlagerung zwischen dem EWS und dem FLI1 Gen entsteht. Das daraus resultierende Fusionsprotein bindet an DNA und verändert die Regulation einer große Anzahl von Genen über unterschiedliche Mechanismen. Frühere Untersuchungen weisen darauf hin, dass vorübergehende Schwankungen der EWS-FLI1 Expression die Plastizität von Ewing Sarkomzellen befördern. Auch wurden in primären Tumoren geringe Zahlen von Zellen beobachtet, welche ein Genexpressionsmuster aufweisen, das experimentell mit niederen EWS-FLI1 Spiegeln und hoher Metastasierungsfähigkeit verbunden ist. Wir wollen nun diese Hypothese überprüfen und jene Faktoren identifizieren, welche für die EWS- FLI1 Schwankungen verantwortlich sind. Es sollen sowohl EWS-FLI1 modulierende zelluläre Signalwege als auch Umweltfaktoren, die diese auslösen, identifiziert und bezüglich ihrer Wirkung auf Tumorzellplastizität und Metastasierung untersucht werden. Andererseits werden wir den Einfluss verschiedener EWS-FLI1 Konzentrationen auf nachgeordnete genregulatorische Prozesse und daraus abgeleitete Auswirkungen auf Wachstums und Metastasierung charakterisieren. Dazu dient ein neues Ewing Sarkom Modell, in dem wir endogenes EWS-FLI1 mit einer fluoreszierenden Domäne versehen, und es mit einem sogenannten Degron verbunden haben, welches pharmakologisch einen raschen, kontrollierten, teilweise oder vollständigen Abbau des Fusionsproteins ermöglicht. Dieser Trick wird uns erlauben, die Menge an EWS-FLI1 in der Tumorzelle schrittweise zu vermindern, und die Grenzkonzentrationen für Wachstum, Invasion und Wanderung der Tumorzellen, sowie die Regulation von dafür verantwortlichen Genklassen mit unterschiedlicher EWS-FLI1 Affinität genau zu bestimmen. Die automatisierte Verfolgung der Fluoreszenzabnahme des Fusionsproteins ermöglicht uns, in Hochdurchsatzverfahren molekulare Faktoren, Genaktivitäten und Medikamente zu ermitteln, die EWS-FLI1 Protein Konzentrationen und damit die Invasivität und Migration der Tumorzellen verändern. Dieses Projekt wird daher erstmals die Ursachen und Auswirkungen von Onkogenfluktuationen in einer Krebserkrankung am Beispiel des Ewing Sarkoms untersuchen und neue therapeutische Wege zur Vermeidung von Metastasierung solider Tumoren aufzeigen.

Das Ewing Sarkom (ES), der zweithäufigste bösartige Knochentumor bei Kindern und jungen Erwachsenen, wird von dem onkogenen Fusionsprotein EWS::FLI1 angetrieben. Dabei dürften verschiedene EF-Spiegel mit unterschiedlichen funktionellen Tumorzellstadien einhergehen. In dieser Studie definierten wir die transkriptionellen und phänotypischen Programme, welche mit unterschiedlichen EF-Spiegeln einhergehen und untersuchten Signalwege, Gene, und Substanzen, welche die Höhe der zellulären EF-Proteinkonzentration beeinflussen. Zu diesem Zweck stellten wir ES Zelllinien her, in welchen das endogene EF an einen Fluorophor und ein durch einen Liganden induzierbares Degron gekoppelt ist. Dies erlaubte uns Fluktuationen der EF-Spiegel mit hoher Sensitivität zu verfolgen und einen fein abgestimmten Gradienten unterschiedlicher EF-Konzentrationen zu erzeugen. Wir fanden, dass schon eine geringfügige Abnahme des EF-Spiegels zu signifikant erhöhter Tumorzellwanderung, Invasion und Metastasierung führte, während das oberflächenunabhängige Tumorzellwachstum verloren ging. Wir identifizierten verschiedene Gruppen von Genen, welche mit unterschiedlicher Sensitivität auf akute EF-Verminderung unterschiedlicher Amplituden reagierten, und konnten die verschiedenen Antwortmuster spezifischen EF-abhängigen Regulationsmechanismen zuordnen. Überraschenderweise führte eine komplette Widerherstellung der EF-Expression nach ein bis vier Wochen der Modulation, um vorübergehende Onkogen Fluktuationen zu simulieren, zu Ausbildung eines proliferierenden hybriden Tumor Zellphänotyps mit erhöhtem Metastasierungspotential. Dieses Zellstadium war von der erhöhten Expression einer spezifischen Gruppe von Genen gekennzeichnet, von denen einige mit schlechter Patientenprognose einhergingen. Um physiologische Mechanismen der EF-Modulation zu erforschen, führten wir ein Substanzen- und ein genomweites Gen-Knockout Screening im Hochdurchsatz durch. Unter 2500 untersuchten Substanzen, welche wir in zwei ES Zelllinien getestet hatten, fanden wir, dass eine Reihe von Histon-Deacetylase-Inhibitoren und Hemmstoffe des PI3K/AKT Signalweges die EF-Proteinspiegel senkten, während Hemmstoffe der mitotischen Spindel und der späten Zellzyklusphasen zu einer EF-Erhöhung führten. Der Gen-Knockout Screen bestätigte die EF-modulierende Rolle des PI3K/AKT Weges, auf welchem mehrere Rezeptor-Tyrosinkinase vermittelte Signale wie etwa IGF-1 konvergieren. Interessanterweise fanden wir in einem EF transgenen Mausmodell, dass EF exprimierende embryonale mesenchymale Knochenvorläuferzellen durch IGF-1 in hohen Konzentrationen wie sie während der menschlichen Pubertät, der Lebensphase mit der höchsten ES Inzidenz, vorzufinden sind, vollständig tumorös transformiert werden. Genomische und epigenomische Charakterisierung identifizierte einen IGF-1 abhängigen Tumor fördernden Mechanismus, welcher durch Aktivierung einer Gruppe von durch EF scharf gemachten Genen mittels des Transkriptionsfaktorkomplex YAP/TEAD angetrieben wird. Entsprechend fanden wir, dass eine Kombination von IGF-1 Rezeptor- und YAP/TEAD Inhibitoren synergistisch ES Zellen in dreidimensionaler Sphäroid Kultur töteten. Während dieses Ergebnis möglicherweise einen neuen Weg zur Bekämpfung des ES weist, zeigen unsere Ergebnisse auch, dass der direkte therapeutische Angriff auf EF zu unerwünschter und paradoxer Unterstützung der Tumorprogression beitragen kann, wenn EF nicht vollständig beseitigt wird.