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Die Langerhans Zell Histiozytose (LCH) ist eine seltene Erkrankung des blutbildenden Systems, die durch CD1a und CD207 positive Zellen in tumorähnlichen Läsionen gekennzeichnet ist. Die Bandbreite der Erkrankung reicht von der spontanen Heilung einzelner Läsionen bis hin zu Tumoren in mehreren Organen und systemischen Entzündungen, die eine Behandlung mit Chemotherapeutika erforderlich macht. Allen gemeinsam ist jedoch die Aktivierung des MAPK-Signalweges, welche in 50-60% der Fälle durch eine Mutation im BRAF-Gen (BRAFV600E) ausgelöst wird. Abgesehen von diesen einzelnen MAPK-Signalweg-aktivierenden Mutationen gibt es keine weiteren genetischen Veränderungen. Dies ermöglicht einerseits eine relative einfache Modellierung der Erkrankung, da nur eine Mutation eingefügt werden muss, andererseits hat sich dies als sehr schwieriges Unterfangen dargestellt. Ein grundlegendes Problem ist, dass der Ursprung bzw. die Ursprungszelle nach wie vor unbekannt ist. Daher stellt sich die Frage, in welche Zelle die Mutation eingefügt werden muss. Die bisher benutzten Modelle sind fast ausschließlich Mausmodelle, die zwar einzelne Aspekte der Erkrankung erfüllen, aber in wesentlichen Merkmalen nicht mit der Symptomatik der Patienten übereinstimmen. Mit diesem Projekt möchten wir nicht nur die Herkunft der LCH-Zellen klären, sondern ein neues Modellsystem für LCH und andere BRAFV600E-mutierte Histiozytosen, wie Erdheim Chester oder das Rosai Dorfman Syndrome, entwickeln. Dazu werden wir induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) nutzen, in die wir mittels der CRISPR-Cas9-Methode die BRAF-Mutation heterozygot einfügen. Diese Zellen werden wir entlang der hämatopoetischen Linie differenzieren, um die Auswirkungen der Mutation in den verschiedenen Zelltypen zu analysieren bzw. den Entwicklungsweg der hämatopoetischen Zellen hin zu LCH-Zellen nachzuvollziehen. Weiters werden wir mit der Kombination zweier Sequenziermethoden den Einfluss der Mutation in unterschiedlichen Zellen, aus Läsionen oder dem Blut von Patienten, untersuchen. Mit Hilfe von 10x single cell sequencing werden wir die Genexpression einzelner Zellen analysieren. Einen Teil der dabei gewonnenen cDNA werden wir mit long-read Oxford Nanopore sequenzieren. Dadurch wird es uns möglich sein, Zellen mit oder ohne Mutation zu unterscheiden, und die jeweiligen Genexpressionsmuster zu vergleichen. Das übergeordnete Ziel dieses Projekts ist es, die grundlegenden Mechanismen, wie BRAFV600E die Entwicklung von Zellen hin zur LCH kontrolliert, zu ergründen und das Zusammenspiel von LCH-Zellen mit Immunzellen zu studieren.