Zellwand- und Aminozucker-Metabolismus von Tannerella forsythia

1) Titel des Projektes. Aufklärung des Zellwand- und Aminozucker-Metabolismus von Tannerella forsythia Relevanz für die Anpassung an das orale Habitat 2) Inhalt des Forschungsvorhabens. T. forsythia (Tf) ist ein pathogenes Bakterium, das orale Biofilme besiedelt und Parodontose auslöst. Seine Zellwand beinhaltet ein typisches Peptidoglykan (PGN) ein netzartiges Stütz- Polymer mit einem Rückgrat bestehend aus den Aminozuckern N-Acetylmuraminsäure (MurNAc) und N- Acetylglukosamin (GlcNAc) sowie einzigartigen Glykoproteinen, die mit Aminozuckern und einer Zuckersäure modifiziert sind. Das Fehlen des generellen bakteriellen de-novo Syntheseweges für die stoff- wechselaktiven Vorstufen von GlcNAc und MurNAc legt nahe, dass für die Vermehrung von Tf, wofür auch Zellwandmaterial vermehrt werden muss, diese Vorstufen entweder wiederverwertet oder von anderen Biofilm- Bakterien oder oralen Geweben bezogen werden müssen. Ziel dieses Projekts ist es, die faszinierende Abhängigkeit des Pathogens von MurNAc zu verstehen, eine weitere mögliche Abhängigkeit von GlcNAc zu beleuchten, den PGN-Syntheseweg in Tf aufzuklären sowie ein eventuelles Wechselspiel mit der Amino- zucker- und Zuckersäure-Synthese der Glykoproteine, welche auch GlcNAc benötigt, aufzuzeigen. Dieses Wissen ist entscheidend für das Verständnis der Überlebensstrategien des Pathogens in oralen Biofilmen. 3) Hypothesen. (a) Eigenen jüngsten Arbeiten zur Folge gibt es in Tf eine neuartige MurNAc-Recyclingroute zur Erzeugung der stoffwechselaktiven Vorstufe. Es werden Schlüsselenzyme dafür charakterisiert, der Bezug von externem MurNAc, dessen Wiederverwertung aus PGN-Abbauprodukten, sowie die Verbindung von PGN Synthese und Rezyklisierung untersucht. (b) Basierend auf unserem Postulat eines bisher unbekannten Syntheseweges für stoffwechselaktives GlcNAc, werden auch hierfür Enzymkandidaten charakterisiert sowie die Rolle von externem GlcNAc untersucht. (c) Um ein detailliertes Verständnis des Zellwandmetabolismus zu erhalten, soll außerdem untersucht werden, ob Tf Aminozucker selbständig synthetisieren kann oder ob es für die Synthese von Zellwandvorstufen von externen Nahrungsquellen abhängig ist, wie beispielsweise von Zuckersäuren, die ihrerseits das Biofilmwachstum des Bakteriums fördern, oder von Aminozuckern der oraler Zellen. Da Zuckersäuren und MurNAc ähnliche chemisch Strukturen darstellen, wird auch eine mögliche Verbindung zwischen Zuckersäure-Metabolismus und PGN-Synthese untersucht. (d) Letztendlich wird in einer Biofilmstudie mit anderen oralen Bakterien evaluiert, ob und wie die PGN-Synthese von Tf auf Stoffwechsel- produkte anderer oraler Bakterien zurückgreifen kann. 4) Methoden. Dieses Projekt ist als internationale Kooperation zwischen C. Mayer (Universität Tübingen, DEU) und C. Schäffer (Universität für Bodenkultur Wien, AUT) konzipiert und basiert auf einem komple- mentären Repertoire an apparativer Ausstattung und Expertise in den Bereichen Kohlenhydrat-Biochemie, Zell- wand-Metabolismus, Radioisotopen-Markierung, Massenspektrometrie (C. Mayer), Glykobiologie, Kohlen- hydrat-Analytik, Genetik von Tf, Kultivierung von Anaerobiern, Biofilm und Elektronenmikroskopie (C. Schäffer). Röntgenstrukturanalysen ausgewählter Komponenten und Proteomics-Studien ausgewählter Komponenten werden mit Projektpartnern durchgeführt. 5) Was ist das Neue/Besondere an dem Projekt? Dieses Projekt wird neue Routen im Zellwandmetabolismus von Bakterien skizzieren, die über Tf hinaus gültig sind. Gleichzeitig werden neue Ansatzmöglichkeiten für die Behandlung von Parodontose aufgezeigt.

Periodontitis ist eine globale bakterielle Entzündungserkrankung des Zahnhalteapparats; sie ist die Hauptursache für Zahnausfall und beeinflusst systemische Erkrankungen wie Diabetes oder Alzheimer. Daran beteiligt ist ein Biofilm aus pathogenen Bakterien, der sich in sauerstofffreien Bereichen der Zahntaschen an der Zahnoberfläche bildet (Zahnplaque). Das detaillierte Verständnis dieser Biofilm-Bakterien ist wichtig für die Entwicklung zielgerichteter Strategien zur Kontrolle und Behandlung der Infektionskrankheit. In diesem Zusammenhang wurde der Zellwand-Metabolismus des oralen Pathogens Tannerella forsythia untersucht. Es war bekannt, dass das Bakterium in Laborkultur einen essentiellen Zellwandbestandteil (N- Acetylmuraminsäure) als Wachstumsfaktor benötigt, denn eine intakte Zellwand ist Voraus- setzung für die Lebensfähigkeit und somit Pathogenität eines Bakteriums. Wir haben erkannt, dass T. forsythia eine Defizienz in wichtigen Genen der Zellwand-Biosynthese besitzt, was es auch resistent gegen das Antibiotikum Fosfomycin macht. Dem Projekt liegt die Annahme zu Grunde, dass das Bakterium neuartige Wege zur Zellwand-Biosynthese entwickelt hat und dabei auch Zellwandbestandteile anderer Biofilmbakterien im oralen Habitat einbezieht. Durch eine Kombination von mikrobiologischen, genetischen, biochemischen, synthese-chemischen, analytischen und mikroskopischen Ansätzen, gelang es in einer internationalen Kooperation zwischen Forschungsgruppen an der Universität für Bodenkultur Wien und der Eberhard-Karls Universität Tübingen, Deutschland, zunächst den Aufbau des Zellwand-materials (Peptidoglykan) von T. forsythia aufzuklären und das Vorhandensein von N- Acetylmuraminsäure zu bestätigen. Es hat sich gezeigt, dass T. forsythia ein konventionelles Peptidoglykan besitzt. Wachstumsversuche unter definierter Zugabe von N-Acetylmuramin- säure haben ergeben, dass dieser Zucker über einen neuartigen, spezifischen Transporter in die Zelle importiert und dann mittels zweier neuartiger Enzyme in eine Vorstufe zum Einbau in die Zellwand umgewandelt wird beziehungsweise durch ein weiteres neues Enzym (MurK Kinase) in die zelluläre Energiegeneration einfließt. Parallel dazu verwendet das Bakterium größere Zellwandbestandteile, die im Zuge des Zellwand-Umbaus während der Zellteilung sowie von abgestorbenen Biofilm-Bakterien freigesetzt werden. Die Bedingungen im oralen Habitat wurden durch die Zugabe von definierten, enzymatisch hergestellten Peptidoglykan- Fragmenten sowie von isoliertem Peptidoglykan verschiedener Bakterien zu einer T. forsythia- Kultur simuliert. Wir haben gezeigt, dass das Bakterium gezielte Strategien zur Aufbereitung, Aufnahme und Weiterverarbeitung von externem Zellwandmaterial besitzen; dabei spielt der Membrantransporter AmpG eine Schlüsselrolle, dessen Spezifität wir bestimmen konnten. Dieses Projekt hat einen mechanistischen Einblick in ein neuartiges Konzept in der bakteriellen der Zellwandbiosynthese gegeben. Es hat für das orale Pathogen T. forsythia neue essentielle Enzyme und Transporter mit neuartigen Spezifitäten aufgezeigt, die Ansatzpunkte für dringend benötigte, innovative Therapieansätze gegen Periodontitis darstellen könnten. Die Erkenntnisse aus diesem Projekt haben somit Anwendungspotenzial im Bereich der Biomedizin.