Meiotische Rekombinationsmechanismen und Regulation

RekombinationistdereinzigeMechanismus fürfehlerfrei Reparaturvon DNS Doppelstrangbrüche (DSBs) und daher essentiell für die Bewahrung genomischer Integrität. In diploiden Organismenwird Rekombinationwährend derMeiose,das Zellteilungsprogramm, welches haploide Gameten hervorbringt, eingesetzt. Daher stellen Fehler im Prozess der Rekombination kausale Ursachen für das Auftreten von Krebs, Unfruchtbarkeit und Fruchtschäden dar. Während der meiotischen Rekombination werden DSBs willentlich generiert und unter Verwendung des homologen Chromosoms als Crossover (CO) oder None-Crossover (NCO) repariert. Beide Reparaturwege sind essentiell fürReproduktion; COformen eine physische Verbindung zwischen homologen Chromosomen, so dass diese in der meiotischen Anaphase I voneinander segregieren können. Überschüssige DSBs müssen über den NCO-Mechanismus repariert werden um die genomisch Integrität wieder vollends herzustellen. Im vorgestellten Projekt werde ich den Modellorganismus C.elegans benützen, um herauszufinden wie diese beiden Rekombinationsmechanismen eingesetzt und reguliert werden. Ich plane genetische, genomische, biochemische und zytologische Methoden anzuwenden, um Mechanismen zu untersuchen die für beide, CO- und NCO-Reparatur, benötigt werde. Des Weiteren werde ich untersuchen, wie der jeweilige Reparaturweg gewählt wird um die genomische Integrität und Segregation von Chromosomen zu gewährleisten. Erstens plane ich den Mechanismus der Rekombination zwischen homolgen Chromosomen und die Wahl zwischen CO- und NCO-Reparaturwege durch die Analyse von DNS an Stellen, an denen Rekombination stattgefunden hat zu untersuchen. Dieser Ansatz inkludiert: A) Die kontrollierte Einführung eines DSB an einem spezifischen genomischen Lokus gefolgt von der genetischen und sequenzbasierenden Auswertung der Reparatur und B) DieDetektion von ReparatursignaturallermeiotischenDSBs mittels Genomsequenzierung. Dadurch werde ich die Muster von Genkonversionen die mit verschieden Reparaturmechanismen assoziiert sind identifizieren. Dieser Ansatz wird mir auch ermöglichen denBeitrag verschiedenerKomponentender meiotischen Rekombinationsmaschinerie zu eruieren und klären ob die relative Position eines DSB entlang eines Chromosoms einen spezifischen Reparaturmechanismus begünstigt. Zweitens werde ich die Rolle von COSA-1, einem Protein das sich spezifisch an den Stellen im Genom akkumuliert, die für CO-Reparatur designiert sind, bezüglich Wahl und Ergebnis des Reparaturmechanismus untersuchen. Hierzu werde ich COSA-1 spezifisch zu einem artifiziell generiertem DSB dirigieren um zu überprüfen, ob die Anreicherung von COSA-1 ausreicht um die Wahl des Reparaturmechanismus zu Gunsten von CO zu beeinflussen. Ich plane die Immunopräzipitation von COSA-1 gefolgt von massenspektrometrischen Analysen um Interaktoren und post-translationale Modifikationen zu bestimmen um so neue Erkenntnis über Regulationen und Mechanismen von CO-Etablierung zu erlangen. Drittens werde ich die DNS, welch mit COSA-1 assoziiert ist, präzipitieren und sequenzieren um eine genom-weite Landkarte von meiotischen CO zu erstellen. Diese wird uns ermöglichen spezifische Sequenz- oder Chromatinmerkmale zu identifizieren, die meiotische Rekombination zu Gunsten von CO beeinflussen. Zusammengefasst wird im vorgeschlagene Projekt erarbeitet wie die essentielle Balance zwischen CO und NCO Reparaturergebnis etabliert wird und so eine fehlerfrei Aufteilung der Chromosomen und Instandhaltung der genomischen Integrität während der Meiose gewährleistet wird.

Um Genomverdopplung mit jeder Generation zu verhindern, wird die Anzahl der Chromosomen während der Meiose, der letzte Zellteilung, bevor Chromosomen in Sperm- und Eizelle verpackt werden, durch zwei, direkt aufeinanderfolgende Teilungen, halbiert, wobei die Erste homologe Chromosomen trennt. Um zuverlässig voneinander getrennt zu werden, müssen sich homologe Chromosomen vorübergehend verbinden. Diese geschieht durch den Austausch von zwei Chromosomenarmen zwischen den homologen Chromosomen; ein Crossover (CO). COs entstehen durch die, von Meiose-spezifischen DNS-Reparaturfaktoren orchestrierte Reparatur, eines gebrochenen Chromosoms unter der Verwendung des intakten homologen Partners als Reparaturschablone. Um sicherzustellen, dass jedes Chromosomenpaar mindestens ein CO erhält, wird in der Meiose die DNS an vielen Stellen absichtlich gebrochen. In der Regel wird nur ein einziges CO pro Chromosomenarm gebildet. Überschüssige Brüche werden durch alternative Mechanismen repariert, um die gnomische Integrität wiederherzustellen, aber ohne COs zu erzeugen. Fehler in der Meiose sind die Hauptursache für Fehlgeburten und Geburtsfehler (z.B.: Down Syndrom). Wie nur ein einziger DNS Bruch zuverlässig in ein CO umgewandelt wird, aber gleichzeitig alle anderen DNS-Brüche, in der selben Zelle und auf demselben Chromosomenarm, so repariert werden, dass sie kein CO liefern, ist ungeklärt. Im Laufe dieses Projekts entwickelten und nutzten wir neuartige zytologische Methoden, um den zeitlichen Verlauf der Lokalisation evolutionär konservierter meiotischer DNS-Reparaturfaktoren an DNS Bruchreparaturstellen zu erheben. Mit Hilfe hochauflösenden Mikroskopie (SIM) haben wir außerdem die dynamische Architektur dieser DNS-Reparaturmaschinen bestimmt. Dieser Ansatz ermöglichte: 1. die physische Natur der zugrundeliegenden DNS-Reparaturintermediate, 2. die Kinetik von CO- und Nicht-CO-Reparatur und 3. die Gesamtzahl der während der Meiose prozessierten DNA-Brüche zu erheben. Weiteres beobachteten wir, dass der Synaptonemal Complex (SC), eine komplexe Proteinstruktur zwischen gepaarten homologen Chromosomen, ein Kompartiment erzeugt, welches das zukünftige COs vorübergehend umschließt. Im Gegensatz, DNS Reparatur, die kein CO liefert findet außerhalb dieser Kompartimente statt. Diese Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse darüber, wie unterschiedliche Reparaturstellen gleichzeitig unterschiedlich behandelt werden können. Biochemische und echtzeit-mikroskopische Analysen zeigten, dass eine spezifische Polo-Kinase physisch mit der DNS-Reparaturmaschinerie interagiert und, von einer Reparaturstelle startende, progressiv entlang des Chromosomenpaar lokalisiert und dabei den SC, Chromosom-autonom, stabilisiert. Polo-Aktivität und der SC sind sowohl für (stabile) homologe Reparaturintermediate als auch für die CO-Bildung erforderlich. Daher postulieren wir, dass Polo-Kinaseaktivität den SC in Reaktion auf DNS-Reparatur modifiziert, um die Anzahl von COs auf einem gegebenen Chromosomenpaar zu kontrollieren.