Markerproteine Herzkreislauferkrankungen

Das wesentliche Ziel des vorliegenden Projektes besteht darin, neue molekulare Marker zu identifizieren, mit denen das Risiko abgeschätzt werden kann, an einer Herzkreislauferkrankung zu erkranken. Das Projekt basiert auf neueren Daten, wonach die Akkumulation von seneszenten, d.h. gealterten, Endothelzellen in der Gefäßwand ein wesentlicher pathogener Faktor bei der Entstehung von Herzkreislauferkrankungen darstellt. Die Arbeitshypothese besteht darin, dass lösliche Proteine, welche von seneszenten Endothelzellen sezerniert werden, als mögliche Markermoleküle für die Früherkennung von Herzkreislauferkrankungen dienen0könnten. Um diese Hypothese zu verifizieren, sollen in einem ersten Schritt geeignete Kandidatengene identifiziert werden, welche für Markerproteine kodieren, die von seneszenten Endothelzellen sezerniert werden. Dazu soll zum Einen ein in vitro Zellkulturmodell mit menschlichen Endothelzellen verwendet werden, andererseits sollen durch eine Analyse der Genexpression, in Gefäßbiopsien von Spendern verschiedener Alternsgruppen, weitere Hinweise über altersabhängig hochregulierte Gene erhoben werden. In einem zweiten Schritt soll dann klinisches Material, gewonnen von Patienten mit Herzkreislauferkrankungen bzw. gesunden Kontrollen, verwendet werden, um die Befunde unserer in vitro Studien zu validieren. Dies könnte dann die Basis darstellen für die Entwicklung neuer diagnostischer Testkits. Um diese Ziele zu erreichen, sind folgende Experimente geplant: in einem ersten Schritt werden wir sezernierte und membran-assoziierte Proteine identifizieren, welche in seneszenten Endothelzellen überexprimiert und in den extrazellulären Raum abgegeben werden, sei es durch normale Sekretion oder durch die Abspaltung der Ektodomäne von Membran-verankerten Proteinen. Im nächsten Schritt sollen gegen interessante Kandidatenproteine Antikörper generiert werden. Mit diesen Antikörpern kann dann die Abundanz entsprechender Proteine bzw. Proteinfragmente in Extrakten und Überständen von menschlichen Endothelzellen studiert werden. Diese Antikörper sollen langfristig auch dazu benutzt werden, um für besonders interessante Kandidatenproteine spezifische ELISA Assays zu entwickeln und in Patientenseren Patienten zu testen. Dieser Schritt wird verbunden mit einer Machbarkeitsstudie, wobei in Zusammenarbeit mit einem Privatunternehmen die Möglichkeit getestet wird, neuartige diagostische Systeme, basierend auf so genannten Zytobeads, für die hier vorgesehene Anwendung auszutesten.

Ziel des Projektes war die Identifizierung von neuen Proteinmarkern, die für die Früherkennung von Herz- Kreislauf-Erkrankungen verwendet werden können. Die dem Projekt zugrunde liegende Hypothese besteht darin, dass alternde menschliche Endothelzellen eine wesentliche Rolle bei der Ätiologie von Herz-Kreislauf- Erkrankungen spielen. Ein erstes Projektziel bestand darin, potentielle Markerproteine zu identifizieren, welche in Personen mit subklinischer Dysfunktion des Endothels nachgewiesen werden können. Da nach Literaturlage eine positive Rolle von seneszenten Zellen bei kardiovaskulären Erkrankungen anzunehmen ist, wurden gemäß der Arbeitshypothese diejenigen Proteine identifiziert, welche von seneszenten Endothelzellen nach außen abgegeben werden und deshalb im Patientenserum nachweisbar sein sollten. Hier wurden durch zwei verschiedene Screening- Ansätze ca. 40 extrazelluläre Proteine identifiziert, welche von seneszenten Zellen im Vergleich zu jungen Zellen verstärkt exprimiert werden. In einem weiteren Schritt wurde, um funktionelle Marker von lediglich korrelativen Markern zu unterscheiden, in einigen Fällen eine Funktionsanalyse der entsprechenden Proteine durchgeführt. Dabei wurde gezeigt, dass einige der sezernierten Proteine wie zB IGFBP6, TL1A/VEGI und IGFBP3 den Seneszensvorgang nicht nur als Marker begleiten, sondern eine Rolle als Regulatoren der Seneszenz spielen. In einem weiteren Teilprojekt wurden ausgewählte Gene aus der oben genannten Gruppe mit Hilfe von in-situ- Hybridisierung darauf untersucht, inwiefern sie in Gefäßbiopsien von alten Spendern und Spendern mit Herz- Kreislauf-Erkrankungen erhöht exprimiert sind. Diese Studie wird demnächst abgeschlossen werden. Ausserdem wurde die Analyse einiger nicht-sezernierten Proteine in die Analyse mit aufgenommen, was insbesondere für den cdk-Inhibitor p16 zu recht interessanten Ergebnissen führte. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe Grillari wurden monoklonale Antikörper für zwei ausgewählte sezernierte Markerproteine hergestellt. Die Etablierung und Austestung von entsprechenden Sandwich-ELISAs wird voraussichtlich in 1-2 Jahren abgeschlossen werden. In dem Projekt wurde somit die Grundlage für die Entwicklung eines diagnostischen Kits gelegt, welcher nach Fertigstellung zunächst in klinischen Pilotstudien auf seine Eignung im diagnostischen Bereich getestet werden soll.