Kapillarsäulen f. HPLC-ESI-MS u. CEC-ESI-MS v. Nucleinsäuren

Aufgrund der großen Bedeutung von Nucleinsäuren für die Forschung im Bereich der Biowissenschaften wurde die Entwicklung verschiedener Techniken für deren Isolierung, Trennung, Charakterisierung und Quantifizierung notwendig. Vor allem die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und die Kapillarelektrophorese eignen sich aufgrund ihrer hohen Trennleistung besonders gut für die Trennung und Analyse von Nucleinsäuren auch in den komplexen Proben biologischen Ursprungs. Die Entwicklung der Electrospray-Ionisierung in den frühen 80er Jahren hat durch ihre einzigartige Massengenauigkeit eine weitere Dimension für die Charakterisierung von biologischen Makromolekülen durch Massenspektrometrie eröffnet. Allerdings ist die massenspektometrische Analyse von Nucleinsäuren mit Schwierigkeiten verbunden, die aus der Tendenz zur Bildung von Addukten mit ubiquitär vorkommenden Kationen wie Natrium und Kalium resultieren. Die Entfernung von Salzen aus Nucleinsäure-Probe ist daher unabdingbar, um Massenspektren hoher Qualität auch von geringen Probemengen erhalten zu können. Das primäre Ziel dieses Projektes ist daher die Entwicklung neuer flüssigchromatographischer und kapillarelektrochromatographischer Trennsysteme für Nucleinsäuren, die sich zur direkten Kopplung mit der Electrospray-Massenspektrometrie eignen. Die Trennmethoden müssen dabei die Funktion der Probenkonzentrierung, Probenentsalzung und Trennung von Nucleinsäuren übernehmen, wobei die Bedingungen so zu wählen sind, daß eine massenspektrometrische Detektion mit hoher Empfindlichkeit möglich ist. Die Entwicklung neuer Methoden für die Analyse von Nucleinsäuren im Rahmen dieses Projektes besteht in der Kombination verschiedener Technologien, nämlich: 1. Synthese und Modifizierung neuer polymerer stationärer Phasen, 2. Miniaturisierung der Trennsysteme, 3. Entwicklung geeigneter Komponenten für die Instrumentierung und 4. Optimierung der Trennbedingungen für empfindliche Massendetektion. Polymere stationäre Phasen werden mittels des Zwei-Phasen-Suspensionsprozesses hergestellt und chemisch an der Oberfläche modifiziert. Die Miniaturisierung der Trennsysteme wird durch die Verwendung von Kapillarsäulen mit Durchmessern von 320 bis 50 m m erreicht, die sowohl für Kapillar-Flüssigkeitschromatographie als auch für die Kapillar- Elektrochromatographie verwendet werden. Als chromatographischer Trennmechanismus kommt die Ionenpaar- Umkehrphasenchromatographie mit nicht porösen, polymeren stationären Phasen in Kombination mit flüchtigen Eluentensystemen zur Anwendung. Die entwickelten und optimierten stationären Phasen werden in verschiedenen Bereichen wie Analytik synthetischer Oligonucleotide, Trennung von DNA Restriktionsfragmenten und Nachweis von diagnostisch relevanten PCR-Produkten angewandt.

Es wurden neue, hocheffiziente Analysensysteme für die Untersuchung von Nukleinsäuren, Proteinen und Peptiden in biologischen Proben entwickelt. Die Analysensysteme basierten auf der Trennung der zu untersuchenden Analyten mittels Kapillar-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und deren anschließender on-line Detektion und Charakterisierung mittels Elektrospray-Ionisations Massenspektrometrie (ESI-MS). Mit Hilfe der im Projekt entwickelten, miniaturisierten Kapillarsäulen-Technologie konnten erstmals äußerst geringe Mengen (einige 100 attomol) von Nukleinsäure-Mischungen gleichzeitig getrennt und massenspektrometrisch charakterisiert werden. Es konnte ein signifikanter Einfluss der verwendeten Materialen auf das Analysenergebnis gezeigt werden. Noch bessere Trennergebnisse wurden durch die Verwendung von so genannten monolithischen Trennmaterialien als stationäre Phase erzielt. Im Gegensatz zu klassischen stationären Phasen, die aus kleinen Teilchen zusammengesetzt sind, bestehen die monolithischen stationären Phasen aus einem einzigen Stück eines porösen Polymers mit für die Chromatographie besonders günstgen Eigenschaften. Die von uns entwickelten monolithischen Phasen stellen die zur Zeit effizientesten bekannten stationären Phasen für die chromatographische Trennung von Nukleinsäuren dar. Die monolithischen Säulen wurden in Folge auch für die Trennung von Peptiden und Proteinen erfolgreich optimiert. Auch hier konnten neue Trennsysteme erarbeitet und optimiert werden, die in Bezug auf Trennleistung zu den effizientesten heute bekannten zählen. Die monolithischen Trennsysteme wurden in Verbindung mit der ESI-MS zur Bearbeitung biochemischer bzw. proteomischer Fragestellungen angewandt. In Zusammenarbeit mit der TU München wurde die Nitrierung von Proteinen in der Gasphase durch umweltrelevante Schadstoffe untersucht. In einer Zusammenarbeit mit der Universität Viterbo, Italien, wurden die an der Photosynthese beteiligten Proteine analysiert. Es wurde eine neue Variante des Antennenproteins lhcb 1 detektiert und dessen aminoterminale Sequenz bestimmt, die für die supramolekulare Organisation des Photosystems II von großer Bedeutung ist. In einem weiteren Schwerpunkt des Projektes wurde die Möglichkeit zur Gewinnung von Sequenzdaten über Nukleinsäuren mittels Tandem-Massenspektrometrie untersucht. Wir konnten zeigen, dass sequenzspezifische Informationen über Oligonukleotide mit einer Länge von bis zu 80-meren generierbar ist. Mit Hilfe eines von uns entwickelten, Computer-unterstützten Sequenzierungsalgorithmus konnte diese Sequenzinformation vollautomatisch ausgewertet werden. In Kooperation mit der Stanford University wurde die Sequenzierungsmethode erfolgreich zur Detektion genetischer Variation und für die medizinische Diagnostik eingesetzt.