Regulation und Rolle lokaler Calcium Gradienten im Endothelium

Forschungsprojekt P 14586Regulation und Rolle lokaler Calcium Gardienten im EndothelWolfgang GRAIER09.10.2000 Es ist nach wie vor faszinierend wie ein so einfaches Molekül wie Ca2+ ein so selektiver Mediator für eine Vielzahl von Zellfunktionen sein kann. Im wichtigsten Organ zur Regulation der lokalen Durchblutung, dem Gefäßendothel, zeigt sich die zentrale Rolle des Ca2+ in besonders beeindruckender Weise. So reguliert Ca2+ die Bildung vasoaktiver Substanzen die sowohl relaxierende (z.B. Stickstoffmonoxid) als auch kontrahierende (z.B. Endothelin) Wirkungen besitzen. Zusätzlich aktiviert Ca2+, neben einer Reihe anderer Faktoren, noch Transkriptionsfaktoren und mitogene Enzyme und steuert so die Genexpression, und wirkt einer Apoptosis entgegen. Diese Vielzahl an manchmal sogar oppositionellen Effekten des Ca2+ zeigt jedoch keineswegs eine eher unspezifische Rolle des Ca2+ an. So können Endothelzellen, zumindest in gesunden Blutgefäßen, sehr genau zwischen den einzelnen Ca2+-sensitiven Mechanismen unterscheiden und diese selektiv "ansteuern". Dabei wird vermutet, dass dieses "Ca2+ Paradoxon" durch ein streng lokalisiertes Ca2+ Signal bewerkstelligt wird. So ist es nicht verwunderlich, dass in Endothelzellen mehrere Isoformen von mindestens acht Ca2+-transportierenden Proteinen (z.B. Transporter und Ionenkanäle), mehrere Ca2+-sensitive Ionenkanäle für Ca2+, Na+, K+ oder Cl- und mindestens vier Ca2+-beinhaltende Zellorganellen (Mitochondrien, Endoplasmatisches Retikulum, Golgi und Nukleus), die konzertant die lokale bzw. globale Ca2+ Konzentration regulieren, zu finden sind. Dieses Projekt soll die funktionelle Kooperation dieser Regulatoren untersuchen und die Bedeutung der lokalen Ca2+ Regulation für akute (z.B. Bildung von Stickstoffmonoxid) und langzeitige (z.B. Genexpression) Zellfunktionen klären. Dazu soll ein Gerät entwickelt werden, das die simultane messung von vier Parametern zuläßt (z.B. Ionenkanäle, globale und lokale Ca2+ Konzentration und Transkriptionsfaktoraktivität), es werden Ca2+-sensitive Proteine spezifisch in einzelnen Organellen expremiert und die Expression der Ca2+-transportierenden Proteine genetisch manipuliert. Weiters wird ein Modell vorgestellt an dem man in intakten, aktiven humanen Arterien Gene mittels Virus einschleusen und die Auswirkungen auf Gefäßreaktivität, Signale in Einzelzellen und die Genexpression untersuchen kann. Letzlich soll der Einfluß von Diabetes mellitus auf dieses empfindliche System der lokalen Ca2+ Regulation und der davon regulierten Zellfunktionen untersucht werden. All dies soll zum Verständnis der selektiven Zellregulation beitragen und neue Mechanismen bei der Entstehung der Gefäßkomplikationen im Diabetes aufzeigen.

Das einfache Ion Ca2+ ist ein wichtiges Signalmolekül in der belebten Natur und es gibt es darin kaum einen Prozess, der nicht durch Ca2+ reguliert oder zumindest beeinflusst wird. So ist Ca2+ für die Kontraktion der Muskulatur genauso verantwortlich wie für die Dilatation der Blutgefäße, Zellproliferation oder programmierten Zelltod. Neben seiner ubiquitären Bedeutung beeindruck Ca2+ vor allem durch die Spezifität mit der es vom Organismus eingesetzt wird um ganz gezielt einen Effekt aus der Vielzahl Ca2+-abhängiger Prozesse zu initiieren. Ziel dieses Projektes war es, die Mechanismen, die solch faszinierende Selektivität ermöglichen, in Endothelzellen zu untersuchen. Am Beginn dieser Arbeit stand die Hypothese, dass die Bildung isolierter Ca2+ Signale innerhalb der Zelle die spezifische Regulation bestimmter Zellfunktionen (z.B. Genexpression) steuern. Die erfolgreiche Erfassung solcher lokalen, oft nur wenige 100 nm 2 großen, Ca2+ "Nester" erforderte die Entwicklung neuer bzw. die Verbesserung vorhandener Methodiken, sowie die Entwicklung bzw. den Einsatz sensorischer Proteine, die in bestimmten Arealen der Zelle akkumulieren und so die Messung physiologischer Vorgänge bzw. des Ca2+ in klar definierten Bereichen innerhalb der Zelle erlauben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die überragende Selektivität des Ca2+ Signals auf ein konzertantes Zusammenspiel von ca. 30 Ionen- transportierender Proteine in der Zellwand, dem Endoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien zurückzuführen ist. So gelingt es den Zellen bei Stimulierung zwischen der Zellmembran und dem Endoplasmatischen Retikulum Ca2+ auf das bis zu 100-fache der basalen Konzentration zu erhöhen, während die zytosolische Ca2+ Konzentration nur um das ca. 8-fache steigt. Noch viel eindrucksvoller erscheint die Tatsache, dass Mitochondrien zur selben Zeit zwischen sich und der Plasmamembran keine, oder nur sehr geringe, Ca2+ Anstiege zulassen, obwohl es genau dort zum Einstrom des Ca2+ aus dem Extrazellularraum kommt. Dabei nehmen die Mitochondrien das einströmende Ca2+ auf, um es in weiterer Folge gezielt in Richtung des Endoplasmatischen Retikulums abzugeben. Dieses Zusammenspiel zwischen den Organellen und der Plasmamembran konnte als wichtigster Regulator Ca2+- abhängiger Prozesse (z.B. Genexpression) aber auch als Angriffspunkt verschiedenster Dysfunktionen unter pathologischen Verhältnissen (z.B. Diabetes mellitus) beschrieben werden.