Funktion von Tetrahydrobiopterin in der NO-Biosynthese

In den vergangenen 10 Jahren wurde ein bedeutender Mechanismus der zellulären Signalübertragung identifiziert, bei dem Stickstoffmonoxid (NO) als Botenstoff fungiert und so eine Vielzahl physiologischer Prozesse reguliert. Im Gefäßsystem senkt NO den Blutdruck und schützt die Blutgefäße vor schädlichen Einflüssen und Funktionsverlust bei Gefäßerkrankungen (Atherosklerose, Diabetes mellitus, Angina pectoris, Herzinfarkt u.a.). Das vorliegende Projekt soll zu einem besseren Verständnis der Biosynthese von NO beitragen. NO wird durch eine Famillie von Enzymen, den sogenannten NO-Synthasen (NOS), aus der Aminosäure L-Arginin gebildet. Es sind drei NOS-Isoformen bekannt: ein Ca2+-abhängiges Enzym das vorwiegend in neuronalen Zellen exprimiert wird, ein endotheliales Enzym, das durch sowohl Ca2+-abhängige als auch Ca2+-unabhängige Mechanismen aktiviert wird und durch Erweiterung von Widerstandsgefäßen eine Blutdrucksenkung bewirkt, sowie ein Zyokin- induzierbares Enzym, das bei entzündlich-infektiven Erkrankungen in einer Vielzahl von Zellen und Geweben (z. B. Makrophagen, glatte Muskulatur, Herzmuskelzellen) exprimiert wird. Die NOS-Reaktion ist ein komplizierter Redox-Prozeß, der nur teilweise aufgeklärt ist. L-Arginin wird in zwei Teilschritten oxidiert, wobei zunächst N G - Hydroxy-L-Arginin als Intermediat entsteht, das dann oxidativ zu L-Citrullin und NO metabolisiert wird. Beide Reaktionsschritte werden durch eine Cytochrom P450-artige prosthetische Häm-Gruppe katalysiert, die vom Kofaktor NADPH bereitgestellte Elektronen für die reduktive Aktivierung von Sauerstoff benötigt, der als Ko- Subbstrat des Enzyms fungiert. Im Unterschied zu anderen Cytochrom P450-Enzymen benötigen alle NOS- Isoformen das Pterin Tetrahydrobiopterin (BH4) als Kofaktor. In kürzlich durchgeführten Untersuchungen wurde eine neuartige Redox-Funktion von BH4 entdeckt, wobei ein Pterin-Radikal als Intermediat der Arginin-Oxidation gebildet wird. Im Rahmen des vorliegenden Projektes sollen die molekularen Prozesse aufgeklärt werden, die an der Bildung dieses Radikals beteilligt sind. Dazu sollen biochemische und biophysikalische Untersuchungen mit Wildtyp und Mutanten rekombinanter humaner NOS-Isoformen durchgeführt werden. Häm-Komplexe und Kohlenstoff-zentrierte Radikale, die als Reaktionsintermediate auftreten, sollen dabei mittels Licht-Absorptions-, Raman- und EPR-Spektroskopie identifiziert werden. Ein Teil der Untersuchungen soll zusammen mit Arbeitsgruppen aus Frankreich, Norwegen und Japan durchgeführt werden, in deren Labors Methoden zum Nachweis reaktiver Intermediate im Millisekunden-Bereich etabliert sind. Da in Zellen exprimierte NOS zumeist nicht mit BH4 gesättigt vorliegt, ist auch die Identfizierung der Reaktionsprodukte bei limitierter BH4- Verfügbarkeit ein wesentliches Projektziel. Unter diesen Bedingungen werden u.a. Superoxid-Radikale und Wasserstoffperoxid gebildet, die möglicherweise an Gewebeschädigungen bei kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sind. Die pathophysiologischen Konsequenzen limitierter BH4-Verfügbarkeit sollen in isoliert perfundierten Herzen untersucht werden, wobei kardiale BH4-Spiegel und Herzfunktion sowohl unter normalen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen in Anwesenheit von Modulatoren der BH4-Biosynthese gemessen werden. Insgesamt soll das vorliegende Projekt wesentlich zum Verständnis der Regulation der NO-Biosynthese beitragen und neue therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen aufzeigen.

In den vergangenen 10 Jahren wurde ein bedeutender Mechanismus der zellulären Signalübertragung identifiziert, bei dem Stickstoffmonoxid (NO) als Botenstoff fungiert und so eine Vielzahl physiologischer Prozesse reguliert. Im Gefäßsystem senkt NO den Blutdruck und schützt die Blutgefäße vor schädlichen Einflüssen und Funktionsverlust bei Gefäßerkrankungen (Atherosklerose, Diabetes mellitus, Angina pectoris, Herzinfarkt u.a.). Das vorliegende Projekt soll zu einem besseren Verständnis der Biosynthese von NO beitragen. NO wird durch eine Famillie von Enzymen, den sogenannten NO-Synthasen (NOS), aus der Aminosäure L-Arginin gebildet. Es sind drei NOS-Isoformen bekannt: ein Ca2+-abhängiges Enzym das vorwiegend in neuronalen Zellen exprimiert wird, ein endotheliales Enzym, das durch sowohl Ca2+-abhängige als auch Ca2+-unabhängige Mechanismen aktiviert wird und durch Erweiterung von Widerstandsgefäßen eine Blutdrucksenkung bewirkt, sowie ein Zyokin- induzierbares Enzym, das bei entzündlich-infektiven Erkrankungen in einer Vielzahl von Zellen und Geweben (z. B. Makrophagen, glatte Muskulatur, Herzmuskelzellen) exprimiert wird. Die NOS-Reaktion ist ein komplizierter Redox-Prozeß, der nur teilweise aufgeklärt ist. L-Arginin wird in zwei Teilschritten oxidiert, wobei zunächst NG- Hydroxy-L-Arginin als Intermediat entsteht, das dann oxidativ zu L-Citrullin und NO metabolisiert wird. Beide Reaktionsschritte werden durch eine Cytochrom P450-artige prosthetische Häm-Gruppe katalysiert, die vom Kofaktor NADPH bereitgestellte Elektronen für die reduktive Aktivierung von Sauerstoff benötigt, der als Ko- Subbstrat des Enzyms fungiert. Im Unterschied zu anderen Cytochrom P450-Enzymen benötigen alle NOS- Isoformen das Pterin Tetrahydrobiopterin (BH4) als Kofaktor. In kürzlich durchgeführten Untersuchungen wurde eine neuartige Redox-Funktion von BH4 entdeckt, wobei ein Pterin-Radikal als Intermediat der Arginin-Oxidation gebildet wird. Im Rahmen des vorliegenden Projektes sollen die molekularen Prozesse aufgeklärt werden, die an der Bildung dieses Radikals beteilligt sind. Dazu sollen biochemische und biophysikalische Untersuchungen mit Wildtyp und Mutanten rekombinanter humaner NOS-Isoformen durchgeführt werden. Häm-Komplexe und Kohlenstoff-zentrierte Radikale, die als Reaktionsintermediate auftreten, sollen dabei mittels Licht-Absorptions-, Raman- und EPR-Spektroskopie identifiziert werden. Ein Teil der Untersuchungen soll zusammen mit Arbeitsgruppen aus Frankreich, Norwegen und Japan durchgeführt werden, in deren Labors Methoden zum Nachweis reaktiver Intermediate im Millisekunden-Bereich etabliert sind. Da in Zellen exprimierte NOS zumeist nicht mit BH4 gesättigt vorliegt, ist auch die Identfizierung der Reaktionsprodukte bei limitierter BH4- Verfügbarkeit ein wesentliches Projektziel. Unter diesen Bedingungen werden u.a. Superoxid-Radikale und Wasserstoffperoxid gebildet, die möglicherweise an Gewebeschädigungen bei kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sind. Die pathophysiologischen Konsequenzen limitierter BH4-Verfügbarkeit sollen in isoliert perfundierten Herzen untersucht werden, wobei kardiale BH4-Spiegel und Herzfunktion sowohl unter normalen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen in Anwesenheit von Modulatoren der BH4-Biosynthese gemessen werden. Insgesamt soll das vorliegende Projekt wesentlich zum Verständnis der Regulation der NO-Biosynthese beitragen und neue therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen aufzeigen.