Membranständige Proteasen und Protein C Inhibitor

Protein C Inhibitor (PCI) ist ein Glykoprotein, welches Serinproteasen durch die Bildung stabiler 1:1 Komplexe hemmt. PCI wird in vielen Organen und Geweben synthetisiert und kommt in vielen Körperflüssigkeiten vor. Er hat eine breite Proteasespezifität. Seine Aktivität gegenüber den meisten Proteasen wird durch Glykosaminoglykane (z.B. Heparin) stimuliert. Vor kurzem konnte die Forschungsgruppe der Antragstellerin zeigen, dass PCI auch verschiedene anionische und/oder oxidierte Phospholipide bindet, und dass diese Phospholipide die Hemmaktivität des PCI stimulieren (Malleier et al., Blood 2007).Bisher wurden hinsichtlich Wechselwirkung mit PCI lediglich Proteasen untersucht, die in Körperflüssigkeiten vorkommen (z.B. Gerinnuns- und fibrinolytische Enzyme, Mitglieder der Gewebekallikreinfamilie). Serinproteasen bzw. deren inaktive Vorstufen sind jedoch nicht nur in Körperflüssigkeiten vorhanden, sondern kommen auch Membran-assoziiert vor. Diese sind entweder Transmembranproteine oder sind mittels eines "GPI-anchors" in der Membran verankert. Membran-assoziierte Serinproteasen scheinen eine Rolle zu spielen bei Zellproliferation und -migration, und daher auch bei Tumorwachstum und Metastasierung. Zur Zeit ist ungeklärt, ob Membran-assoziierte Serinproteasen durch Serinprotease-Inhibitoren gehemmt werden. Wir vermuten, dass PCI eine Rolle in der Regulation dieser Proteasen spielen könnte, da PCI Affinität sowohl für Phospholipide wie auch für Glykosaminoglykane hat und außerdem im Organismus weit verbreitet ist. Es ist das Ziel des vorliegenden Projektes, die Wechselwirkung von PCI mit Membran-assoziierten Proteasen zu untersuchen und den Effekt von Phospholipiden und Glykosaminoglykanen auf diese Wechselwirkung zubestimmen. Wir werden die Wechselwirkung von PCI mit der Protease Testisin im Detail untersuchen, da es in vitro Daten gibt, die nahelegen, dass Testisin eine Zielprotease für PCI ist. Außerdem sind PCI und Testisin in männlichen Keimzellen und in verschiedenen Tumorzelllinien colokalisiert. Im zweiten Teil des Projektes wollen wir neue Membran-assoziierte Zielproteasen für PCI identifizieren, ihre Wechselwirkung mit PCI untersuchen, sowie ihre Colokalisation mit PCI in subzellulären Compartments analysieren. Wir werden dafür verschiedene (Tumor)Zelllinien, die PCI exprimieren, verwenden, sowie Leukozyten, die mit Plasma PCI in Kontakt sind. Von diesen Untersuchungen erwarten wir uns Informationen über die Rolle des PCI für die Regulation lokaler, Zell- assoziierter Proteolyse.

In früheren Untersuchungen konnten wir zeigen, dass der sezernierte, extrazelluläre Proteaseinhibitor Protein C inhibitor (PCI) über einen unkonventionellen Mechanismus unter Beteiligung von Phosphtidyläthanolamin von Zellen internalisiert und in den Zellkern transloziert werden kann. Ziel des Projektes P 20386-B09 war es, zellmembranständige und intrazelluläre Proteine zu identifizieren, die mit PCI interagieren. Mit Hilfe subzellulärer Fraktionierung und Coimmunopräzipitation ist es gelungen, zellmembranständige Proteine wie Enteropeptidase eine Typ II Transmenbranprotease und Testisin eine GPI verankerte Serinprotease zu detektieren. Außerdem konnten wir zeigen, dass PCI mit intrazellulären Proteinen interagiert. CSN6 und CSN5 Untereinheiten des COP9 Signalosoms und eine im Kern vorkommende Isoform des lysosomalen Cathepsins L konnten mit PCI in subzellulären Fraktionen von Leukozyten kolokalisiert werden. In Western Blots konnte PCI Antigen im Kern der Lymphozyten, nicht aber im Kern der Jurkat Lymphoma Zellen detektiert werden. Dies stimmt mit Daten überein, die zeigen, dass das Fehlen von PCI mit bösartigem Verhalten von Zellen assoziiert ist. Es ist bekannt, dass PCI Cathepsin L, das von Krebszellen sezerniert wird, inhibiert. Wir wollten nun untersuchen, ob PCI auch das im Kern vorkommende Cathepsin L hemmt. Jurkat T Lymphoma Zellen wurden mit PCI inkubiert. PCI wurde internalisiert und konnte mit Cathepsin L im Chromatin kolokalisiert werden. Durch die Hemmung des Cathepsins L durch PCI konnte Histone H3 Spaltung verhindert werden. Histone sind Proteine und dienen der Zelle als Spule auf die die DNA gewickelt wird. Weiters konnten wir zeigen, dass ein Abspalten des Proteinendes des Histons H3, das aus der Spule herausragt eine chemische Modifizierung am Histone H4 verhindert. Das Fehlen dieser Modifizierung am Histone H4 ist ein Marker für Krebs. PCI, ein Inhibitor des Cathepsin L, verhindert das Abspalten der Proteinenden des Histons H3 und damit kann diese chemische Modifizierung am Histone H4 wieder eingeführt werden.