Die Orai Aktivierung Maschinerie

Unter einer Vielzahl verschiedener Kalzium-Transportwege in die Zelle, ist bisher jener über den Ca2+ release- activated Ca2+ (CRAC) Kanal am besten charakterisiert. Zu seinen Schlüsselkomponenten zählen der Kalzium- Sensor STIM1 und der Ionenkanal Orai. Nach der Speicherentleerung multimerisieren die STIM1-Proteine, bilden Kluster nahe der Plasmamembran und koppeln an die Orai-Kanäle. Diese Ankopplung erfolgt über die cytosolischen C-Termini beider Proteine und resultiert in einem Kalzium-Einstrom in die Zelle. Ein Ziel dieses Projekts ist, sowohl N- wie auch C-terminale Orai Domänen zu identifizieren, welche für diese Aktivierung essentiell sind. Der Fokus liegt zuerst auf Orai3, welcher sowohl durch STIM1 wie auch 2-APB stimuliert werden kann, um wichtige Regionen für jeden der beiden Stimuli zu bestimmen. Jene Domänen in Orai3, die für die Aktivierung durch STIM1 relevant sind, werden analog auch in Orai1 analysiert. Weiters dienen N- und C-terminale Chimäre von Orai1/3 dazu eine mögliche Kooperation der cytosolischen Stränge des Orai Proteins für die Kanalaktivierung zu entschlüsseln. In einem komplementären Ansatz werden wir auf Konformations-Kopplungs-Aspekte der Orai Aktivierungs- Maschinerie über einen neuen STIM1-abgeleiteten Konformations-Sensor eingehen. Eine Konformationsänderung eines doppelt-markierten C-terminalen STIM1 Fragments aufgrund der Kopplung an unterschiedliche Orai1/3 Konstrukte kann somit deren Funktion zugeordnet werden. Die Resultate dieses Projekts sollen wichtige Determinanten innerhalb der Orai N- oder C-Termini aufdecken, die essentiell für die Orai Aktivierung sind, insbesondere durch STIM1. Die entschlüsselten Regionen könnten dominant negativ mit der Orai Aktivierung interferieren und somit mögliche Angriffspunkte für Medikamente darstellen. Der entwickelte STIM1 Konformations-Sensor ist ein interessantes Tool, um nicht nur die Orai- Funktion mit der STIM1-C-terminus Konformation in Beziehung zu bringen, sondern repräsentiert zusätzlich einen Sensor für die Evaluierung von STIM1 relevanten Pharmaka. Die erzielten Resultate sollen eine Basis schaffen, um neue Angriffspunkte für Medikamente innerhalb der STIM1/Orai-Aktivierungsmaschinerie zu entdecken.

Unter einer Vielzahl verschiedener Kalzium-Transportwege in die Zelle, ist bisher jener über den Ca2+ release-activated Ca2+ (CRAC) Kanal am besten charakterisiert. Zu seinen Schlüsselkomponenten zählen der Kalzium-Sensor STIM1 und der Ionenkanal Orai. Nach der Speicherentleerung multimerisieren die STIM1-Proteine, bilden Kluster nahe der Plasmamembran und koppeln an die Orai-Kanäle. Diese Ankopplung erfolgt über die cytosolischen C-Termini beider Proteine und resultiert in einem Kalzium-Einstrom in die Zelle. Ein Ziel dieses Projekts war, sowohl N- wie auch C-terminale Orai Domänen zu identifizieren, welche für diese Aktivierung essentiell sind. Weiters galt es, Konformationsänderungen während dieser Aktivierung sichtbar zu machen. Zu letzterem Punkt, wurde von uns ein von STIM1-abgeleiteter Konformations-Sensor designt, der erstmalig ermöglichte, bei Bindung von STIM1 an Orai einen switch von einer geschlossenen in eine offene Konformation zu verfolgen. Weiters gelang es, durch Einführung von Mutationen in STIM1 diesen physiologisch, aktiven Zustand von STIM1 zu simulieren, wodurch auf am Konformationsübergang beteiligte Domänen innerhalb von STIM1 geschlossen werde konnte. Aufschlüsse über die an Orai beteiligten Domänen wurden insbesondere an Hand von Orai3 und dessen Aktivierung durch STIM1 wie auch 2-APB erhalten. Wir konnten zeigen, dass die in den Orai Proteinen N-terminal konservierte Domäne essentiell für das Gating des Orai Kanals ist, mit unterschiedlichen Bereichen für die STIM1 und 2-APB vermittelte Stimulierung. Weiters gelang es, die Interaktionstelle des Orai1 C-terminus im Komplex mit einem STIM1 C-terminalem Fragment mit atomarer Auflösung strukturell darzustellen. Im Hinblick auf die Nutzung von Orai/STIM als Angriffspunkt für potentielle immun- regulierende Medikamente wurden neue CRAC Kanal Inhibitoren hinsichtlich deren molekularer Wirkung charakterisiert. Mit den erzielten Resultaten in diesem Projekt gelang es uns, wichtige Determinanten innerhalb der Orai N- und C-Termini aufzudecken, die essentiell für die Orai Aktivierung sind, insbesondere durch STIM1. Der entwickelte STIM1 Konformations-Sensor ist ein interessantes Tool, um nicht nur die Orai Funktion mit der STIM1 C-terminus Konformation in Beziehung zu bringen, sondern repräsentiert zusätzlich einen Sensor für die Evaluierung von