Bindungseigenschaften des PRDM9 Proteins in der Meiose

Meiotische Rekombinations-Hotspots kommen im Genom sehr häufig vor, aber es ist immer noch rätselhaft wie diese Hotspots kontrolliert werden und welche Faktoren ihre Aktivität beeinflussen. Vor wenigen Jahren wurde entdeckt, dass das Protein PRDM9 eine Schlüsselrolle in der Aktivität der Hotspots spielt. Die Funktion des Proteins und dessen Wirkungsmechanismus sind aber immer noch größtenteils unbekannt. PRDM9 ist ein epigenetischer Modifikator und bindet mit seinen langen seriellen Zinkfingern an die DNA und veranlasst infolge die Erzeugung von Doppelstrangbrüchen die zur Rekombination führen. DNA-Motive werden von PRDM9 erkannt und beeinflussen die Bestimmung von Hotspot-Regionen, dennoch gibt es im Genom viele Bereiche mit dem entsprechenden Motiv in denen keine Rekombination stattfindet; oder auch umgekehrt, es gibt Hotspots die kein bekanntes Motiv enthalten. Offensichtlich tragen Sequenz-Motive nur zu einem geringen Teil zur Festlegung von Hotspots bei. Die Erforschung der DNA-Bindungseigenschaften von PRDM9 und dessen biochemische Bindungskinetik würden daher einen wesentlichen Beitrag zum besseren Verständnis der widersprüchlichen Beobachtungen leisten und einen tieferen Einblick in die Bestimmung von Rekombinations-Hotspots gewähren. Ziel dieses Projektes ist die Charakterisierung der PRDM9 Bindung an mehreren humanen Hotspots mittles hoch-quantitativer, biophysikalischer Methoden, die die Messung von Affinitäten und Bindungsraten erlauben. Im Speziellen werden wir 1) die Bindungskinetik zwischen humanem PRDM9 (Variante A) und repräsentativen Hotspot-Sequenzen messen; 2) die Rolle von weiteren Co- Faktoren und Substraten in Bezug auf die Bindungskinetik untersuchen; 3) den Einfluss allelischer Unterschiede in PRDM9 in unfruchtbaren Männern und die Auswirkung dieser Unterschiede auf die Bindungseigenschaften von PRDM9 und damit auf die Rekombination analysieren. Präzise Bindungsaffinitäten (Dissoziationskonstanten; KD) zwischen PRDM9 und DNA werden mittels mikroskaliger Thermophorese (MST) gemessen, eine neue, bedeutende Technik, die das thermophorestische Verhalten der Analyten als freie Moleküle und als Komplex in einem lokalen Temperaturgradienten aufzeichnet und so aufschlussreiche Information über die Affinität der Analyten ergibt. Mit diesem Projekt werden zum ersten Mal das wichtige Zusammenspiel von Spezifität und Bindungsaffinität in der PRDM9-DNA Wechselwirkung analysiert und die wesentliche Frage adressiert welche DNA-Bindungseigenschaften von PRDM9 die Rekombinations-Hotspots festlegen.

Während der Bildung der Keimzellen durch die spezialisierte Zellteilung der Meiose, werden im Prozess der Rekombination das väterliche und mütterliche genetische Material ausgetauscht. Dieser Prozess ist strengstens reguliert und kommt nur an speziell definierten Stellen im Genom vor, so genannte Hotspots. Es ist immer noch rätselhaft wie diese Hotspots kontrolliert werden, jedoch wurde bereits das Protein PRDM9 identifiziert, welches eine wichtige Rolle in der Hotspotregulierung spielt. PRDM9 bindet sequenz-spezifische DNA Stellen, wo auch die Rekombination stattfindet. Dennoch werden im Genom viele Stellen von PRDM9 gebunden die keine Rekombination auslösen. Auch umgekehrt: es gibt Hotspots die keine spezifische Bindestelle für PRDM9 aufweisen. Wie diese dynamischen Bindungseigenschaften zustande kommen, haben wir in diesen Projekt analysiert. Die spezifischen Ziele dieser Arbeit waren die molekularen Bindungseigenschaften von PRDM9 und dessen biochemische Bindungskinetik zu erforschen. Mittels hoch-quantitativer, biophysikalischer Methoden, welche die Messung von Affinitäten und Bindungsraten erlauben, konnten wir 1) die Bindungskinetik von PRDM9 (einer Mausvariante) zu repräsentativen DNA Bindungssequenzen messen; 2) die Rolle unterschiedlicher Bindungssequenzen und deren Auswirkungen im Bindungsverhalten testen; und 3) und bestimmen ob das Protein als Einzelmolekül oder mittels mehrere Einheiten in der Bindung teilnimmt. Die Ergebnisse unserer Forschungsarbeit zeigen, dass das Protein eine sehr feste und stabile Bindung zur spezifischen Bindungssequenzen aufweist und erst nach vielen Stunden wieder von der DNA abfällt. PRDM9 kann außerdem eine große Bandbreite von spezifischen DNA Motiven erkennen und binden, und somit die Rekombination an verschiedene Stellen im Genom auslösen. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass das Protein einen Komplex aus drei Einzelmolekülen bildet, um seine Funktionen auszuüben. Somit können wir erstmals einen Einblick in den zeitlichen Ablauf und die Stabilität der PRDM9-DNA Interaktion gewinnen, und weitere Details über die molekularen Bindungseigenschaften des Proteins erforschen. Diese wichtigen Erkenntnisse tragen dazu bei, den gesamten Ablauf der Rekombination in der Meiose, sowie die Interaktionen verschiedenster Rekombinationsfaktoren, besser zu verstehen.