Rekombinante funktionell aktive Auronsynthases

Aurone sind mit den Flavonoiden biochemisch verwandte gelbe Blütenpigmente, die der Anlockung von Bestäubern dienen. Darüber hinaus sind sie von großem pharmakologischem und biotechnologischem Interesse. Es gibt zwei Grundtypen, 4-Hydroxyaurone und 4-Deoxyaurone, die sich durch das Hydroxylierungsmuster an der Position 4 im A-Ring unterscheiden.Die Biosyntheseder 4-Hydroxyauronewurde im Löwenmäulchen (Antirrhinum majus) sehr gut untersucht. Die Auronbildung wird von der sogenannten Aureusidine synthase (AmAS1) katalysiert, einer spezifischen Polyphenol oxidase (PPO) mit Monophenolaseaktivität. Dies ist einerseits ein neuer Enzymtyp in der Flavonoidbiosynthese und andererseits ein vielzitiertes Beispiel für die Beteiligung von PPOs im Anabolismus. Die 4-Deoxyaurone wurde hingegen lange Zeit vernachlässigt, weil davon ausgegangen wurde dass ihre Biosynthese analog erfolgt. Kürzlich konnten wir jedoch zeigen, dass die Bildung der 4-Deoxyaurone sich in wesentlichen Punkten von der der 4-Hydroxyaurone unterscheidet, wie z.B. dem Enzymtyp, Substratspezifität und Lokalisation des Enzyms. Dieses Projekt soll offene Fragen der 4-Deoxyauronbiosynthese klären. Da bislang neben der AmAS1 nur zwei weitere cDNA Klone aus Coreopsis grandiflora isoliert wurden, CgAUS1undCgAUS2, sollen zunächstweitere Vertreter von Auronsynthasen aus anderen Pflanzen isoliert werden um die Unterschiede zwischen den beiden Auronbiosynthesewegen besser untersuchen zu können. Da im Gegensatz zur CgAUS1, AmAS1 und CgAUS2 aus Blütenblättern nicht in ausreichenden Mengen isoliert werden können, sollen die Arbeiten zur Substratspezifität und Enzymstruktur mit rekombinanten Enzymen durchgeführt werden. Auronsynthasen werden, wie PPOs im allgemeinen, ineiner aktivenProenzymform (latente PPO)gebildet, die durch proteolytischen Schneiden des C-Terminus in aktive Enzyme überführt werden. Daher sollen Vektorkonstrukte hergestellt werden, bei denen in den PPO Genen Schnittstellen für ein gezieltes Schneiden mittels PreScission protease eingebaut sind, um die natürliche proteolytische Prozessierung nachzustellen. Die Substratspezifität der rekombinanten CgAUS2 wird im Detail untersucht und Unterschiede zu CgAUS1, AmAS1 und anderen unspezifischen PPOs analysiert. Rekombinante aktive und latente CgAUS2 wird in größeren Mengen für Kristallisationsversuche gereinigt werden. Das Ziel ist es, Unterschiede zwischen der bereits vorhandene Kristallstruktur der Chalconspezifischen CgAUS1 und der CgAUS2, dievermutlicheinebreitere Substratspezifität aufweist, zu identifizieren, um Struktur/Funktionsunterschiede von PPOs besser verstehen zu können. Das Projekt schafft wesentliche Vorrausetzungen um Funktionen und Strukturen dieser wichtigen Enzymklasse mittels rekombinanten Proteinen untersuchen zu können.

Aurone sind mit den Flavonoiden biochemisch verwandte gelbe Blütenpigmente. Sie dienen der Anlockung von Bestäubern, sind aber auch von großem pharmakologischem und biotechnologischem Interesse. Es gibt zwei Grundtypen, 4-Hydroxyaurone und 4- Deoxyaurone, die sich durch das Hydroxylierungsmuster an der Position 4 im A-Ring unterscheiden. Die Biosynthese der 4-Hydroxyaurone ist im Löwenmäulchen (Antirrhinum majus) bereits sehr gut untersucht. Die 4-Deoxyaurone wurde hingegen lange Zeit vernachlässigt, weil angenommen wurde, dass ihre Biosynthese analog erfolgt. Die Bildung der 4-Deoxyaurone unterscheidet sich jedoch in wesentlichen Punkten von der der 4- Hydroxyaurone. Die sogenannten Auronsynthasen sind das Schlüsselenzym bei der Biosynthese. Sie gehören zur wichtigen Familie der Polyphenoloxidasen. Dieses Projekt sollte offene Fragen der 4-Deoxyauronbiosynthese klären sowie zur Verbesserung der heterologen Expression der Polyphenoloxidasen beitragen. Da zu Projektbeginn neben dem Enzym aus dem Löwenmäulchen nur zwei cDNA Klone aus Coreopsis grandiflora bekannt waren, lag ein wichtiger Schwerpunkt der Arbeit in der Identifizierung und Charakterisierung von bislang unbekannten Vertretern von Auronsynthasen (AUS) aus anderen Pflanzen. Im Rahmen dieses Projekts konnten weitere Vertreter identifiziert und isoliert werden und zwar aus den gelbblühenden Beetpflanzen Schmuckkörbchen, Mädchenauge, Dahlie und Strohblume. Zusätzlich wurden mit Sequenzen von zwei Polyphenoloxidasen aus der Banane gearbeitet. Ein weiterer Schwerpunkt war die Herstellung von rekombinanten Polyphenoloxidasen in latenter und aktivierter Form. Es konnte gezeigt werden, dass die heterologe Expression einer Teilstruktur zur Produktion eines aktiven Proteins ausreichend ist. In weiterer Folge wurde die Bedeutung von Polyphenoloxidasen für Biosynthesewege in verschiedenen Pflanzen untersucht. Dazu wurden einerseits kombinierte biochemische, molekularbiologische und analytische Untersuchungen durchgeführt, andererseits bioinformatische Methoden und Transkriptomanalysen von verschiedenen gelbblühenden Zierpflanzen sowie von Apfel und Banane eingesetzt. Die Biosynthese von Auronen bzw. von anthochloren Pigmente im allgemeinen wurde in verschiedenen Zierpflanzen untersucht und um die Beteiligung von Polyphenoloxidasen an Abwehrreaktionen im Apfel und der Banane erweitert. In Zusammenarbeit mit der Universität Laibach wurde auch die Beteiligung von Polyphenoloxidasen an der Glasigkeit bei Äpfeln untersucht. Das Projekt hat wesentliche Vorrausetzungen geschaffen um Funktionen und Strukturen der wichtigen Enzymklasse der Polyphenole mittels rekombinanten Proteinen untersuchen zu können.