Spezialisierte Polyphenoloxidasen

Tyrosinasen und Catecholoxidasen gehören zur Klasse der Typ-III-Kupferenzyme. Forscher arbeiten seit Jahrzehnten daran, die Monophenolase-/Diphenolase-Spezifität dieser Enzyme auf struktureller Ebene zu erklären und entwickelten dazu eine Hypothese (basierend auf der ersten Catechol- und Tyrosinasestruktur), der zufolge der Grund für das Fehlen von Monophenolase-Aktivität in Catecholoxidasen das strukturell eingeschränkte aktive Zentrum sein könnte. Jüngste strukturelle und biochemische Studien an dieser Enzymklasse liefern jedoch Anlass zu Zweifeln an dieser Theorie. Unsere Arbeitsgruppe hat die erste Kristallstruktur einer pflanzlichen Tyrosinase (Juglans regia) präsentiert, anhand derer gezeigt wird, dass die Unterscheidung zwischen Mono- und Diphenolase-Aktivität auf struktureller Ebene nicht durch eine strukturelle Einschränkung des aktiven Zentrums bestimmt wird; vielmehr spielen Aminosäuren, die sich am Eingang zu und innerhalb der zweiten Schale um das aktive Zentrum befinden, eine viel wichtigere Rolle, als bisher angenommen. Das Projekt wird einen fundamentalen Beitrag zum molekularen Verständnis der Funktion der pflanzlichen Tyrosinasen leisten und damit auch die Grundlage für biotechnologische Prozesse liefern. Die Ziele des Antrages sind die Kristallstrukturen von mehreren mutierten Aminosäuren der zweiten Schale, die um den Eingang zum aktiven Zentrum liegen. Zur Untersuchung wirdeineKombinationvon Proteinisolierung, biochemischer Charakterisierung, molekularbiologischen Methoden und der Röntgenstrukturanalyse eingesetzt.

Polyphenoloxidasen (PPOs) stellen eine Familie von Typ-III-Kupfermetalloenzymen dar, zu denen Tyrosinasen (TYRs), Catecholoxidasen (COs) und Auronsynthase (AUS) gehören. TYRs katalysieren die ortho-Hydroxylierung von Monophenolen (Monophenolaseaktivität) und die anschließende Oxidation der resultierenden ortho -Diphenole zu ortho-Chinonen, während COs nur die letztere Reaktion katalysieren können. Die ortho -Chinone sind hochreaktiv und stellen das Ausgangsmaterial für die Biosynthese von Melanin dar und somit sind PPOs an der Pigmentbildung beteiligt. Unsere Forschungsziele waren die ertragsstarke Produktion sowie die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Pflanzen -PPOs aus Walnuss Juglans regia (jrPPO1), Apfel Malus domestica (MdPPO1-3), Tomate Solanum lycopersicum (SlPPO1-2) und Larreatricinhydroxylase von Larrea tridentata, um Kenntnisse über den strukturellen Unterschied zwischen TYRs und COs und den Reifungsprozesses dieser Enzyme, die in vivo als latente Proenzyme exprimiert werden, zu gewin nen. Wir haben Protokolle für die ertragreiche Expression und Reinigung von Walnuss -, Tomaten- und Apfel-PPOs in rekombinanter Form erstellt, die ausreichende Mengen für die weitere Charakterisierung liefern. Wir identifizierten vier Aminosäurereste, die f ür die Tyrosinase- Aktivität verantwortlich sind, den Wasserträger, den Torwächter und die beiden Aktivitätsregulatoren. Darüber hinaus haben wir an einem neuartigen Aktivierungsprozess von PPOs gearbeitet: Die strukturelle und biochemische Charakterisierun g von PPO1 aus Malus domestica (MdPPO1) zeigt die Selbstspaltung als Aktivierungsweg für pflanzliche PPOs. Die Umwandlung von inaktiven Pro-Polyphenoloxidasen (pro-PPOs) in die aktiven Enzyme resultiert aus der proteolytischen Spaltung ihrer C-terminalen Domäne. Die in der Linkerregion zwischen der aktiven und der C-terminalen Domäne befindliche Sequenz Lys355-Val370 ist für die Selbstspaltung unverzichtbar, da eine Mutante, der dieses Peptid fehlt, keine Selbstspaltung zeigt. Eine teilweise Einführung (Lys352-Ala360) dieses Peptids in die Sequenz von zwei PPOs, MdPPO2 und Auronsynthase (CgAUS1), löste eine Selbstspaltung in den resultierenden Mutanten aus. Dies ist der erste experimentelle Beweis für ein Selbstspaltungs-induzierendes Peptid in PPOs, der einen neuen Aktivierungsmodus für diese Enzymklasse aufzeigt, der von externer Protease unabhängig ist. Wir entwickelten einen In Crystallo-Aktivitäts-Assay das auf der Verwendung von Wildtyp-Kristallen und Mutanten-Kristallen der Apfeltyrosinase beruht. Durch Zugabe des monophenolischen Substrats Tyramin und des diphenolischen Substrats Dopamin zu kristallhaltigen Tropfen wird die Auswirkungen der Mutation auf die Aktivität des Enzyms mittels Farbveränderungen der Kristalle infolge der Umwandlung der Substrate in dunkle Chromophorprodukte beobachtet.