RNA-gesteuerte DNA-Methylierung in der Pflanzenentwicklung

Pflanzliche Entwicklung ist sehr flexibel dadurch, dass Pflanzen unwirtlichen Bedingungen nicht ausweichen können, müssen sie ihre Form und ihren Stoffwechsel an ihre Umgebung anpassen, mit einer spektakulären Ausprägung: der post-embryonalen Organogenese. Abhängig von ihren Bedürfnissen, bilden unterschiedliche Individuen ihre Organe an unterschiedlichen Stellen aus, wofür es ein robustes System zum Reprogrammieren und Sichern der Identität der involvierten Zellverbände benötigt. Pflanzenhormone, wie zum Beispiel Auxin, spielen eine wichtige Rolle bei der Initiierung und Positionsbestimmung des Reprogrammierungsprozesses. Neben Hormonen oder externen Reizen kann auch die physische Beschaffenheit der kodierenden DNA, vor allem die Methylierung von Cytosinen, in hohem Maße ihren on/off Status, Expressionsraten oder die Reaktion auf diverse Stimuli beeinträchtigen. Daraus ergibt sich die Fragestellung, ob Pflanzenhormone, zumindest teilweise, die Genexpression über den Methylierungsgrad der entsprechenden Gene beeinflussen können, oder im Gegenteil, ob die Methylierung der DNA den Wirkungsgrad von Hormonen bestimmen kann. Um diese wichtigen Fragen beantworten zu können, steht uns mit einer kürzlich entdeckten Mutation ein ausgezeichnetes Werkzeug zur Verfügung, bei der ein einzelner Aminosäurenaustausch in einer Untereinheit (NRPE5) des DNA-Polymerasekomplexes Pol V zu einer anomalen hormongesteuerten Entwicklung wie auch veränderten DNA-Methylierung führt. An diesen Mutanten werden wir die globale Genexpression und, parallel dazu, den detaillierten Methylierungsgrad der Gene mittels Next Generation Sequencing (NGS) analysieren. Diese Mutante (genannt freak show, fks) zeigt eine Reihe von einzigartigen und auffälligen Phänotypen, deren Charakterisierung und Zuordnung zu den verursachenden Genomabschnitten es uns ermöglichen wird, die methylierungsabhängigen Entwicklungsprozesse genauer zu beschreiben. Durch die Kombination von fks mit Mutationen an unterschiedlichen Abschnitten im Prozess der DNA-Methylierung können wir die weitere Rolle von NRPE5 bei der Methylierung und Aufrechterhaltung von methylierten DNA-Abschnitten analysieren. Der Vergleich von fks mit anderen NRPE5 Allelen lässt vermuten, dass es sich bei dieser Mutation nicht um eine Inaktivierung, sondern um eine Veränderung der Funktion des Pol V Komplexes handelt. Ob diese Veränderung von einer anomalen Selektivität, Spezifität, Affinität, Effizienz, der Verwendung einer anderen Untereinheit oder ähnlichem beruht, stellt eine weitere interessante Frage dar, die wir mit unterschiedlichen biochemischen Methoden beantworten wollen Assays zur Analyse von Proteinwechselwirkungen mit anderen Polymerase-Untereinheiten werden erste Aufschlüsse bieten. Die Charakterisierung des nrpe5fks Allels und dessen Nutzung in der weiteren Forschung wird uns völlig neuartige Informationen zum mechanistischen Verständnis über die Funktion und Hormonabhängigkeit von Pol V sowie ihrer Beteiligung an DNA-Methylierung in höheren Pflanzen liefern.

Für einen vollständigen und ordnungsgemäßen Lebenszyklus reicht es nicht aus, alle Gene zu haben, die für jede Funktion erforderlich sind, sondern es muss auch die Information vorhanden sein, ob, wo und wie ein Gen arbeiten darf. Ein Teil dieser Information ist in Form von DNA-Methylierung kodiert, einer chemischen Veränderung an ausgewählten Cytosin- Gruppen in den Chromosomen. Eine solche Modifikation kann die Fähigkeit von Proteinen, mit der DNS zu interagieren, beeinträchtigen, was sich auf die Funktionalität eines Gens auswirkt. Je nach Ort und Dichte dieser Modifikation können Gene selektiv an- oder abgeschaltet und ihre Aktivität innerhalb eines akzeptablen Bereichs gehalten werden. In höheren Pflanzen wird die Cytosin-DNA-Methylierung hauptsächlich durch einen Prozess abgelegt, der als RNA- gesteuerte DNA-Methylierung (RdDM) bezeichnet wird, während die DNA-Methylierung im Zuge der DNA-Replikation (z. B. bei der Zellteilung und wenn Pflanzen wachsen) meist durch verschiedene Mechanismen auf die neue DNA übertragen wird, wobei der wichtigste der so genannte MET1-Prozess ist. In den aktuellen Lehrbüchern heißt es, dass der Herzstück von RdDM und der MET1-Weg kaum etwas miteinander zu tun haben, sie interagieren nicht und ihre Komponenten sind unterschiedlich. Im Allgemeinen sehen Pflanzen mit gestörtem RdDM erstaunlich gesund aus, während sich Pflanzen ohne eine ordnungsgemäße MET1- Maschinerie nicht normal entwickeln und häufig ihren Lebenszyklus nicht beenden können. In unserer Forschung arbeiteten wir mit einer neuartigen Mutante namens freak show (fks) von Arabidopsis, einem kleinen Unkraut, der Labormaus der Pflanzenforschung. In fks sieht eine wichtige Komponente von RdDM nicht so aus, wie sie sollte. Anstatt die molekularen Merkmale von RdDM-Mutanten zu zeigen und ansonsten gesund zu sein, sieht fks sowohl makroskopisch als auch auf molekularer Ebene aus wie eine Pflanze ohne einen voll funktionsfähigen MET1-Reaktionsweg. Mit Hilfe genetischer und biochemischer Methoden konnten wir bestätigen, dass dieses seltsame Verhalten durch die veränderte RdDM- Komponente verursacht wird. Unsere Ergebnisse deuten auf eine unerwartete mechanistische Überschneidung zwischen den beiden wichtigsten DNA-Methylierungsmechanismen hin. Die abnorme RdDM-Komponente fks beeinträchtigt eindeutig die Effizienz der DNA-Methylierung durch MET1 und stellt damit das derzeitige Dogma von unabhängigen DNA- Methylierungsprozessen in Pflanzen in Frage. Ob es sich dabei um einen physiologisch bedeutsamen, direkten oder indirekten Effekt handelt, ist noch eine offene Frage und erfordert weitere Forschungsarbeit. Aber ein wichtiger Schritt zu einem besseren Verständnis des Mechanismus der DNA-Methylierung ist gemacht worden.