Enzyme mit gekoppeltem dinuklearen Kupferzentrum

Die Proteinfamilie der gekoppelten binuklearen Kupferproteine (GBKs) besteht aus vier Un - terklassen, den Hämocyaninen, der Tyrosinasen, der Catecholoxidasen und den Enzymen mit Hydroxyanilin-Aktivität, die vor kurzem in diese Proteinfamilie eingeordnet wurden. Die GBKs zeichnen sich durch ein gekoppeltes binukleares Kupferzentrum aus. Die Hauptaufgabe von Hämocyaninen besteht darin, Sauerstoff in Gliederfüßer und Weichtieren zu transportieren, wohingegen Catecholoxidasen und Tyrosinasen die Oxidation von Diphenolen zu den entsprechenden Chinonen oxidieren (Diphenolase -Aktivität). Tyrosinasen sind zudem in der Lage, Monophenole in ortho-Position zu hydroxylieren (Monophenolase- Aktivität). Die vierte Unterklasse, zu der die Enzyme NspF und GriF gehören, setzt o- Aminophenol zu o-Nitrophenolen um (Hydroxyanilin-Aktivität). Während die Proteinstrukturen einiger Repräsentaten der ersten drei Unterklassen bereits gelöst wurden, sind die Strukturen von NspF und GriF unbekannt. Ihre Zugehörigkeit zu der GBK-Familie wurde jedoch mittels spektroskopischer und durch Mutagenese-Studien nachgewiesen, die zeigten, dass die Enzyme ein sehr ähnliches aktives Zentrum besitzen. Somit sind die a ktiven Zentren aller vier Mitglieder der GBK-Familie, trotz unterschiedlicher katalytischer Funktionen und Substratspezifitäten, strukturell sehr ähnlich. Die Unterschiede in der Aktivität konnten bislang nicht auf einer molekularen Ebene geklärt werden. Das Hauptziel dieses Projektes ist die Kristallisation und Strukturlösung von NspF und GriF, um spezifische, strukturelle Merkmale zu identifizieren, die möglicherweise erklären könnten warum diese Enzyme Hydroxyanilinase-Aktivität besitzen, während andere GBK-Mitglieder diese Aktivität fehlt. Zusätzlich werden die Aktivitäten von NspF, GriF und Tyrosinase mit einer Reihe von Substraten getestet, um die Substratspezifität dieser Enzyme zu bestimmen. Mit Hilfe der strukturellen und kinetischen Daten sollen Aminosäuren identifiziert werden, die für die Aktivität wichtig sind und anschließend mutiert werden, um ihre Wichtigkeit zu verifizieren. Die Ergebnisse dieses Projekts werden deutlich zur Aufklärung des katalytischen Mechanismus von GBK-Enzymen beitragen und eine Antwort auf die Frage liefern welche Faktoren für die unterschiedlichen Aktivitäten und Substratspezifitäten dieser Oxidaseklasse verantwortlich sind.