Mechanistische Evaluierung eines TRPV6 Ca2+ Kanal Inhibitors

Kalzium ist ein divalentes Kation und in vielen physiologischen Prozessen, wie Immunabwehr und Hämostaseologie, involviert. Der TRPV6-Kanal (transient receptor potential vanilloid 6), ein Mitglied der TRP-Superfamilie, ist sehr Kalzium-selektiv und in Form eines Tetramers in der Plasmamembran lokalisiert. Die Expression in Intestinum- oder Plazentazellen sowie die Überexpression in malignen Tumoren der Brust und Prostata zeigen die Beteiligung des TRPV6 bei wichtigen Zell-Signalwegen. Obwohl TRPV6 nicht in normalem Prostatagewebe exprimiert ist, ist es in Prostatakrebszellen hochreguliert. TRPV6 Ionenkanäle sind daher ein interessantes Ziel für die Entwicklung neuer Hemmsubstanzen. Zudem gibt es bisher nur eine in-human Phase-I Studie mit einem TRPV6 Blocker. Erst kürzlich wurde ein neuer Inhibitor, cis-22a, entwickelt. Das Ziel dieses Projektes ist es, diesen Blocker zu untersuchen und ihn mit anderen, potentiellen Hemmsubstanzen in TRPV6 exprimierenden HEK293 Zellen mittels Kalzium-Fluoreszenz Imaging und der Patch Clamp-Technik zu vergleichen. Weiters wird der hemmende Effekt auch an Brust- und Prostata-Krebszellen, welche TRPV6 Ionenkanäle endogen exprimieren, untersucht. Die Auswirkung des Blockers auf die Krebszell-Invasivität wird durch Proliferations- und Zellmigrations-Assays zusätzlich charakterisiert. Ein weiterer Teil des Projekts widmet sich der Opto-Pharmakologie, wobei TRPV6 durch einen photo- schaltbaren Blocker in seiner hemmenden Wirkung durch Licht beeinflusst werden kann. Dazu werden licht-aktivierbare Derivate des cis-22a entwickelt und getestet. Insilico Untersuchungen der cis-22a Bindungsstelle mittels Molecular Dynamics Simulationen sollen anschließend durch funktionelle Analyse dieser mutierten TRPV6 Kanäle bestätigt werden. Zusammenfassend zielt das Projekt auf die Charakterisierung der Eigenschaften und Bindungsstelle des cis-22a Blockers und der Entwicklung eines spezifischen, photo- aktivierbaren TRPV6 Inhibitors ab, deren potentielle Einsatzgebiete in der Krebstherapie liegen könnten.

Kalzium ist ein divalentes Kation und in vielen physiologischen Prozessen, wie Immunabwehr und Hämostaseologie, involviert. Der TRPV6-Kanal (transient receptor potential vanilloid 6), ein Mitglied der TRP-Superfamilie, ist sehr Kalzium-selektiv und in Form eines Tetramers in der Plasmamembran lokalisiert. Die Expression in Intestinum- oder Plazentazellen sowie die Überexpression in malignen Tumoren der Brust und Prostata zeigen die Beteiligung des TRPV6 bei wichtigen Zell-Signalwegen. Obwohl TRPV6 nicht in normalem Prostatagewebe exprimiert ist, ist es in Prostatakrebszellen hochreguliert. TRPV6 Ionenkanäle sind daher ein interessantes Ziel für die Entwicklung neuer Hemmsubstanzen. Zudem gibt es bisher nur eine in-human Phase-I Studie mit einem TRPV6 Blocker. Erst kürzlich wurde ein neuer Inhibitor, cis-22a, entwickelt. Das Ziel dieses Projektes war es, diesen Blocker zu untersuchen und ihn mit anderen, potentiellen Hemmsubstanzen in TRPV6 exprimierenden HEK293 Zellen mittels Kalzium-Fluoreszenz Imaging und der Patch Clamp-Technik zu vergleichen. In silico Untersuchungen der cis-22a Bindungsstelle mittels Molecular Dynamics Simulationen wurden anschließend durch funktionelle Analyse dieser mutierten TRPV6 Kanäle bestätigt und komplementiert durch Analyse der Kristallstruktur eines TRPV6 Kanals im Komplex mit cis-22a. Dabei zeigte sich eine neue, zusätzliche cis-22a Bindungstelle am Porenausgang, die physiologisch vom Kalzium-Binde Protein Calmodulin zur Inaktivierung von TRPV6 benützt wird. Darauf aufbauend erfolgte eine detaillierte Analyse zur Regulation des TRPV6 Kanals über Lipide, insbesonders Phosphatidylinostitol-4,5-bisphosphat (PIP2). Hierfür wurden Methoden zur Interferenz der Kanal-PIP2 Interaktion verwendet. In Kombination mit cis-22a als Instrument zur Analyse der Lipidbindestelle sowie der Pore gelang der experimentelle Nachweis für eine allosterische Kopplung der Lipidbindestelle und der Pore. Zudem wurde gezeigt, dass auch eine Rückkopplung von der Pore zur Lipidbindestelle besteht, wobei jedoch der Porenausgang davon ausgenommen ist. Zusammenfassend zielten die Ergebnisse des Projektes auf die Charakterisierung der Eigenschaften und Bindungsstelle des cis-22a Blockers sowie der überlappende Regulation des TRPV6 Kanals über Lipide ab, wodurch potentielle Angriffspunkte für weitere Inhibitoren aufgezeigt wurden.