Pichia Lipidom

Die Hefe Pichia pastoris zählt weltweit zu den am meisten angewandten experimentellen Systemen zur heterologen Expression von Proteinen. Trotz der intensiven kommerziellen Nutzung ist der derzeitige Wissensstand der Biochemie, Zellbiologie und Molekularbiologie dieses Mikroorganismus noch immer sehr beschränkt. Als treffendes Beispiel dafür kann die mangelhafte Information über die Lipide von Pichia pastoris angeführt werden, obwohl klar ist, dass gerade diese Substanzklasse von Biomolekülen sehr großen Einfluss auf Protein-Targeting und intrazellulären Transport von Fremdproteinen hat. Aus diesem Grund wollen wir basierend auf dem Know- How unseres Labors über Organellenanalyse und Lipidbiochemie Biomembranen und Lipide der Hefe Pichia pastoris im Detail untersuchen. Das erste Ziel des vorliegenden Projekts wird es sein, das Lipidom von Pichia pastoris zu etablieren und Mutanten mit modifizierten Lipidmustern zu generieren. Sodann werden wir diese grundlegenden Erkenntnisse über die zellulären Lipide von Pichia pastoris in Proteinexpressionsstudien mit maßgeschneiderten Stämmen zur Anwendung bringen. Dieser Strategie folgend, werden wir zunächst das Lipidom von Pichia pastoris eingehend studieren, wobei nicht nur die mengenmäßig wichtigsten Lipide untersucht werden sollen, sondern auch Lipidkomponenten, die in geringerer Häufigkeit vorkommen. Anschließend wollen wir Schlüsselenzyme des Lipidmetabolismus von Pichia pastoris identifizieren und Hefestämme konstruieren, die Defekte oder Überexpression der entsprechenden Gene aufweisen. Auf diese Weise beabsichtigen wir gezielt Mutanten mit verändertem Lipidmuster herzustellen. Grundlegende phänotypische und biochemische Untersuchungen der neuen Stämme werden bereits Hinweise auf kritische Schritte des Lipidmetabolismus in Pichia pastoris liefern. Schließlich sollen Expressionsversuche von heterologen Proteinen in den neu konstruierten Stämmen unternommen werden, insbesondere von membranassoziierten Polypeptiden, für die eine veränderte Membranumgebung von großer Bedeutung sein sollte. Diese Informationen und die entstandenen Stämme werden publik gemacht und der "Pichia Community" für die Anwendung zur Verfügung gestellt. Auf diese Weise wird das Projekt Grundlagenwissenschaft und angewandte Forschung in sinnvoller Weise verknüpfen und einen neuen Beitrag zur heterologen Proteinexpression in Pichia pastoris leisten.

Die Hefe Pichia pastoris zählt weltweit zu den am meisten angewandten experimentellen Systemen zur heterologen Expression von Proteinen. Trotz intensiver Nutzung dieses Systems ist der Wissensstand der Biochemie, Zellbiologie und Molekularbiologie zu diesem Mikroorganismus noch immer sehr beschränkt. Als treffendes Beispiel dafür kann die mangelhafte Information über die Lipide von Pichia pastoris angeführt werden, obwohl klar ist, dass gerade diese Substanzklasse von Biomolekülen sehr großen Einfluss auf Protein-Targeting und intrazellulären Transport von Fremdproteinen hat. Aus diesem Grund führten wir basierend auf dem Know-How unseres Labors über Organellenanalyse und Lipidbiochemie Untersuchungen an Biomembranen und Lipiden der Hefe Pichia pastoris durch. Das erste Ziel des Projekts war es, das Lipidom von Pichia pastoris zu etablieren und nach Möglichkeit die Gesamtheit der Lipide in den verschiedenen Organellen der Hefe zu analysieren. Zu diesem Zwecke wurden frühere Arbeiten zu diesem Gebiet erweitert und verfeinert. Diese Studien führten zu wichtigen Resultaten, wie z.B. zur Erfassung des Lipidoms von Microsomen (Endoplasmatisches Reticulum), der Plasmamembran und der sog. Lipid Droplets. Als zweites Ziel wurden Mutanten der Lipidbiosynthese generiert und charakterisiert. Hervorzuheben sind in diesem Zusammenhang Pichia pastoris Stämme mit Defekten in der Synthese und im Abbau von Triglyceriden. Die Erkenntnisse dieser Arbeiten wurden in ein industrienahes Projekt (ACIB; Austrian Center of Industrial Biotechnology) eingebracht und lieferten dort wertvolle Hinweise bei Proteinexpressionsstudien. Die Informationen aus dem TRP-Projekt und die entstandenen Stämme wurden publik gemacht und der Pichia Community für die Anwendung zur Verfügung gestellt. Auf diese Weise wurde Grundlagenwissenschaft und angewandte Forschung in sinnvoller Weise verknüpft und ein neuer Beitrag zum Verständnis der Zellbiologie von Pichia pastoris geleistet.