Biokatalytische Reduktion von Carbonsäuren

In nachwachsenden Rohstoffen findet man Carbonsäuren in signifikanter Zahl und Menge. Man könnte diese Verbindungsklasse theoretisch zur Herstellung von Kunststoffen, Aldehyden oder speziellen Alkoholen aus biologischer Herkunft nutzen, jedoch stellt die Reduktion von Carbonsäuren noch immer eine große Herausforderung für die Chemie und auch die Biokatalyse dar, da Carboxylate thermodynamisch ausgesprochen stabil sind. Das bedeutet, dass ein großes Maß an Aktivierung nötig ist um sie zur Reaktion zu bringen. Chemische Methoden benötigen aus diesem Grund meist mehrere Stufen, organische Lösungsmittel, toxische Reagenzien, sehr hohe oder sehr niedrige Temperaturen oder den übermäßigen Gebrauch von Reduktionsequivalenten. Die enzymatische Reduktion von Carbonsäuren ist leider noch keine echte Alternative, da das Verständnis der Reaktion auf molekularer Ebene ungenügend ist und nur zwei Vertreter dieser Enzymklasse für Biokatalyse in preparativem Maßstab zur Verfügung stehen. Von der Mehrheit der beschriebenen Carboxylatreduktasen ist noch keine Sequenzinformation bekannt. Ein Ziel ist es daher, die Aminosäuresequenzen einiger Carboxylatreduktasen mit Hilfe von Strukturmodell- gestützter Datenbanksuche zu entschlüsseln. Die Proteine werden sodann in Escherichia coli oder Pichia pastoris exprimiert und danach wird ihre Aktivität mittels chromatographischer Methoden überprüft. Aktive Enzyme sollen auch mit einer photometrischen Methode biochemisch charakterisiert werden und zusätzlich werden wir versuchen, die erste Kristallstruktur einer Carboxylatreduktase zu lösen. Weiters werden wir wichtige Aminosäurereste identifizieren, indem sie durch ortsspezifische Mutagenese gegen andere Reste ausgetauscht werden. Einen Hinweis, welche Reste mutiert werden sollen, wird uns ein Strukturmodell oder idealerweise die gelöste Kristallstruktur liefern. Zusammenfassend wird dieses Projekt einen substantiellen Beitrag zum Verständnis von Carboxylatreduktasen und ihrer Funktionsweise liefern und zusätzlich neue Enzyme für die Biokatalyse verfügbar machen.

Nachwachsende Rohstoffe sind eine ausgezeichnete Quelle für Carbonsäuren. Man könnte diese Verbindungsklasse für viele Produkte biologischer Herkunft nutzen, jedoch stellt die Reduktion von Carbonsäuren eine große Herausforderung dar. Die Säuren sind sehr stabil und schwierig in andere Bausteine zu überführen. Die Natur löst dieses Problem, indem sie spezielle Enzyme für diese Reduktion von Carbonsäuren zu reaktiven Aldehyden einsetzt. Zu Beginn dieses Projektes waren noch sehr viele Fragen zu dieser Enzymklasse offen. Es gab lediglich zwei Enzyme, die man auf Sequenzebene kannte, man wusste kaum etwas über die Funktionsweise dieser Enzyme auf molekularer Ebene und unter diesen Voraussetzungen ist es nahezu unmöglich, sie für die nachhaltige Synthese von Aldehyden zu nutzen. Unser Ziel war es, die Aminosäuresequenzen einiger Carboxylatreduktasen mit Hilfe von Strukturmodell- gestützter Datenbanksuche zu entschlüsseln. Hierbei lag der Fokus auf Organismen, für die die entsprechende Aktivität literaturbekannt war. Die Reduktasen wurden dann in einfachen Mikroogranismen (zum Beispiel Escherichia coli) produziert. Auf diese Weise konnten wir fünf neue Carboxylatreduktasen entschlüsseln und im Detail untersuchen. Wir haben Aminosäurereste identifiziert, die für die Reaktion essentiell sind und den Grundstein für die Aufklärung der Kristallstruktur für pilzliche Carboxylatreduktasen gelegt. Zusammenfassend hat dieses Projekt einen substantiellen Beitrag zum Verständnis von Carboxylatreduktasen und ihrer Funktionsweise geliefert und neue Enzyme für die Biokatalyse verfügbar gemacht.