Neuroblastomrezidiv/Resistenzbekämpfung durch Aufklärung der Tumorheterogenität (ONTHETRRAC)

Für etwa 60% der Hochrisikopatienten mit einem Neuroblastom (NB) endet diese Erkrankung mit einem tödlichen Ausgang. MolekulareMarker und drug targets Bestimmungen basieren auf kleinsten Biopsien großer Tumoren. Die Ansicht, dass NBs genetisch homogen sind, ist mittlerweile überholt und diese Vorgehensweise daher nur begrenzt tauglich. Will man prädiktive Biomarker identifizieren, muss man auch intra- tumorale Heterogenität (ITH)berücksichtigen. ONTHETRRAChat deshalbein internationales Expertenteam für molekulare Genetik und klinische Forschung beim NB zusammengestellt und baut auf deren jüngsten Erkenntnissen über die, sowohl räumliche als auch zeitlich auftretende, Heterogenität auf. Diese betrifft sowohl die Intratumorheterogenität, Heterogenität zwischen Primärtumor/Metastase und zwischen Diagnose/Rezidiv. Wir werden die neuesten genomischenranskriptomischen/proteomischen/metabolischen/flüssigen Biopsie - Technologien einsetzen um Strategien zu entwickeln, die diese ITH berücksichtigen und die exakte Analysen von prädiktiven Biomarkern unterstützen. Die Validierung der Biomarker wird durch die in Maus- und Zebrafischmodellen, simulierte klonale Entwicklung unterstützt. Ziele von ONTHETRRAC sind: klinisch relevante Empfehlungen zu erarbeiten, wie die molekulare Diagnose und das Monitoring des Krankheitsverlaufs, unter Berücksichtigung der räumlichen und zeitlichen ITH auf der (sub)klonalen Ebene, durchzuführen sind. Die daraus resultierenden Diagnose- und Monitoring-Richtlinien werdenbei der Entwicklung neuer gezielter therapeutischer Interventionen sehr wichtig sein und werden direkt in die nächsten Europäischen Hochrisiko- und Rezidiv-Studien-Protokolle für NB einfließen initiiert von Partnern, die auch bei SIOPEN und GPOH Studienkommissionen vertreten sind wonach immerhin 99% der NB Hochrisikopatienten in Europa behandelt werden. ONTHETRRAC hat somit die Möglichkeit die räumliche/zeitliche ITH besser zu detektieren, und somit individualisierte therapeutische Strategien zu entwickeln, die auf den aggressivsten und resistentesten Klon abzielen. Minimal invasive Techniken werden dabei die Möglichkeit vergrößern Mutationen und den Schweregrad der Krankheit während der Behandlung zu beobachten. Wir schlagen dafür einen äußerst innovativen Ansatz vor, der als wissenschaftliche Basis für einen Paradigmenwechsel nötig ist, und der von der diagnostischen Einzelbiopsie zu einer multiplen Tumoranalyse und vor allem zur flüssigen Biopsie bei der Behandlung von Neuroblastompatienten, führen wird.

Für 60% der pädiatrischen Hochrisikopatienten bedeutet ein Neuroblastom immer noch eine tödlich verlaufende Erkrankung. Um diese Patienten genauer diagnostizieren/behandeln zu können, ist es daher unerlässlich, prognostische/prädiktive Faktoren zu definieren. Derzeit verwendete molekulare Marker stammen zum Teil von Biopsien mit minimaler Tumorzellzahl, die unter der (falschen) Annahme gewonnen bzw. beurteilt wurden, dass ein Tumor genetisch homogen ist. Die intratumorale Heterogenität (ITH) muss bei der Identifizierung von prognostischen/prädiktiven Markern unbedingt berücksichtigt werden. Wir haben daher innovative Omics- und Flüssigbiopsie-Methoden angewandt, um die verschiedenen Aspekte der intratumoralen Heterogenität, der räumlichen und zeitlichen Heterogenität, inklusive Diagnostik mit Rückfalls-Vergleichen, genau zu untersuchen. Unsere Genomdaten von Tumor- und Knochenmarksproben stammen von 155 Neuroblastompatienten und untermauern die Hypothese einer verzweigten klonalen Evolution und parallelen Entwicklung von primären und metastasierenden Tumorzellen. Die Suche nach Biomarkern mit deren Hilfe der Rückfalls- Klon identifiziert werden könnte, sollte daher, neben dem Tumorgewebe, auch diagnostische disseminierte Tumorzellen (DTC) involvieren (Abbasi et al. 2017). Diese Genomdaten wurden mit den RNA-Sequenzierungsdaten von DTC ergänzt. Die Analyse der RNA- Sequenzierungsdaten der DTC machten deren einmaliges Expressionsprofil im Vergleich zum Expressionsprofil der Tumoren und mononuklären Blutzellen sowie die weniger ausgeprägten Unterschiede zwischen diagnostischen und Rückfalls-DTC sichtbar. Letztere betreffen bevorzugt die Herunterregulierung von Chromosom 19 kodierten Genen (zum Teil Tumorsuppressorgenen). Da diese Veränderungen mit dem Nichtansprechen der Behandlung oder einem Rückfall assoziiert sein könnten, sollten weitere funktionelle Studien über DTC in Betracht gezogen werden (Rifatbegovic et al. 2018). Die Amplifikation des MYCN Onkogens ist heute für die Therapiestratifizierung wichtigste prognostische Marker beim Neuroblastom und verlangt bei Vorhandensein, und unabhängig vom Krankheitsstadium, intensive Therapie. Die klinisch/biologische Bedeutung des heterogenen MYCN- amplifizierten (hetMNA) Neuroblastoms war bislang jedoch nicht bekannt. Erst durch die Untersuchung des genomischen Hintergrundes von hetMNA Tumoren unter Verwendung einer kombinierten Einzelzellanalysetechnik mit einer pan-genomischen Analyse von 99 Tumoren, konnten wir prognostische Untergruppen identifizieren, die bis dahin völlig unbekannt waren. Wir schließen daraus, dass die Integration von Alter, Krankheitsstadium und vor allem des genetischen Tumorhintergrundes entscheidend für die Therapiestratifizierung bei hetMNA Neuroblastomen ist. Diese Daten können nun zu einer präzisen Einteilung der betroffenen Patienten in genetisch definierte Behandlungsgruppen führen (Bogen et al. 2016, Berbegall et al. 2018). Obwohl prädiktive Faktoren für die Subkategorisierung der Hochrisiko-Neuroblastompatienten vonnöten wären, gibt es solche bis heute nicht. Wir haben daher eine umfassende Genomstudie von 200 auf die gleich behandelten Neuroblastompatienten (alle im Rahmen der SIOPEN HR-NBL1 klinischen Studie) durchgeführt und haben die Genomdaten mit einem funktionellen Marker, dem Freiwerden des Knochenmarks von Tumorzellen nach der Induktionstherapie, kombiniert. Diese bis jetzt bei diesem Tumor noch nie durchgeführte kombinierte Analyse von funktionellen Daten mit Genommarkern (z.B. PTPRD, ATRX intragenische Deletionen, TERT Aktivierung, 1q Aberrationen) hat zu einer klaren Einteilung in verschiedene prognostische/prädiktive Untergruppen geführt, die eine bessere Krankheitsverlaufsvoraussage ermöglichen, die wiederum in künftigen klinischen Studie verwendet werden kann um eine adäquatere Therapie zu entwickeln (Fiedler et al. in submission). Um eine häufige Einschränkung im pädiatrisch-onkologischen Bereich zu überwinden -nämlich die oftmals nur in geringen Mengen verfügbaren Blut- und Knochenmarksproben - haben wir diverse DNA-Isolierungsmethoden, Transportkonditionen und Konservierungstechniken miteinander verglichen um ein Maximum zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) aus kleinen Mengen von peripherem Blut- und Knochenmarksplasma-Proben zu gewinnen. Die technischen Voraussetzungen für die Identifikation von Genomaberrationen in der ctDNA wurden von den Mitgliedern des Konsortiums geschaffen und die Anwendung bei Neuroblastom-ctDNA-Proben konnte somit erfolgreich durchgeführt werden (Gerber et al. Manuskript im Review-Verfahren). Besonders bemerkenswert der Flüssigbiopsie-Techniken ist die Möglichkeit der frühen Rückfallerkennung durch ddPCR Daten aufeinanderfolgender Blutplasmaproben von Hochrisiko-Neuroblastompatienten. Dies ist tatsächlich Wochen vor der klinischen Manifestation möglich (Gerber et al. in Vorbereitung). Daher wird in der nächsten klinischen Hochrisiko-Neuroblastom-Studie, die dieses Jahr starten soll, die neueste Technik zur sorgfältigen Analyse von genomischen Tumoraberrationen durch Flüssigbiopsie- Techniken ergänzt werden um so den Prozess (sowohl Regression wie auch Progression) der Krankheit während der Behandlung besser zu verstehen und die Früherkennung von Rückfällen zu ermöglichen.