Polyoxometallat-unterstützte Proteinkristallisation

Polyoxometallate (POMs) bilden eine große Stoffklasse polyatomischer (Übergangs)metall- Oxyanionen, die ein breites Anwendungsspektrum z.B. in der Katalyse, als Sensoren, in der Bio- und Nanotechnologie, in der Medizin und den Materialwissenschaften besitzen. Bislang gibt es nur sehr wenige Studien, die speziell die Wechselwirkung zwischen Proteinen und POMs hinsichtlich ihres Potentials zur Unterstützung der Proteinkristallisation untersuchen. Dieses beantragte Projekt wurde konzipiert, um zum grundlegenden molekularen Verständnis der Interaktion zwischen verschiedenen POM-Grundstrukturen und Proteinen beizutragen. Es sollen strukturell bereits bekannte POMs (Na6[V10O28] 18H2O, Na6[TeW 6O24] 22H2O, Na14[NaP5W 30O110] 31H2O und Na6[P2W 18O62] 18H2O) und neue POMs (Anderson-, Keggin- und Lindqvist-POMs) sowie Hydrid-POMs synthetisiert und mittels verschiedener spektroskopischer Techniken und der Röntgenstrukturanalyse charakterisiert werden. Ein Hauptziel ist es sowohl die Wasserlöslichkeit als auch die pH- Stabilität der POM-Verbindungen zu untersuchen. Die Strukturen neuer POM-Protein-Komplexe sollen röntgenographisch untersucht werden. Dazu werden die aufgereinigten Proteine biochemischen und molekularbiologischen Charakterisierungsmethoden und anschließend der Röntgenstrukturanalyse unterzogen. Die Zielproteine sind das Lysozym aus Hühnereiweiß, Proteinase K, humanes apo- Transferrin, humanes Serumalbumin, Myosin, Polyphenoloxidase, Hämocyanin und das Membranprotein Bacteriorhodopsin. Die Ergebnisse dieses Projektes werden zum grundlegenden Verständnis sowohl der physikalischen Eigenschaften von Polyoxometallaten als auch deren Wechselwirkungen mit Proteinen beitragen, an denen es aktuell in der Forschung fehlt. Dieses interdisziplinäre Projekt soll zur Etablierung eines kommerziellen POM-basierten Screening Kits führen, das die Kristallisation vieler Proteine vereinfachen soll. 1

Proteinkristallographie ist die am häufigsten verwendete Methode, um strukturelle Informationen über Zielproteine und Arzneimittel-Zielmolekül Wechselwirkungen zu erhalten. Diese strukturellen Informationen sind unverzichtbar für das Verständnis über den Großteil biologischer Prozesse. Das Erhalten von hochauflösenden Kristallen ist der wichtigste Schritt aber jedoch auch die Engstelle in der Röntgenstrukturanalyse, da dieser Prozess sehr zeit- und ressourcenaufwendig ist und ohne jegliche Garantie auf Erfolg. Das Verwenden von Additiven ist eine etablierte Methode, um die Kristallisation von Proteinen zu erleichtern oder gar zu ermöglichen, jedoch sind Additive nur begrenzt auf einige Proteine und unter bestimmten Bedingungen einsetzbar. Deshalb gibt es das Bestreben ein universelleres Additiv zu etablieren, welches ein breiteres Spektrum an Proteinen adressiert und in der Lage ist, noch strukturell unbekannte Proteine zu kristallisieren. Deshalb haben wir einige Verbindungen aus der Gruppe der Polyoxometallate (POMs) auf ihre Tauglichkeit, als Additive zu fungieren, untersucht. POMs sind Cluster von Übergangsmetall- (u.a. Molybdän, Wolfram) und Sauerstoffatomen, die eine beeindruckende Vielfalt an Größe und Struktur besitzen und zudem hervorragende Eigenschaften und Funktionen. Unsere bisherigen Untersuchungen zeigten, dass das Anderson-Evans Polyoxowolframat [TeW 6O24]6- (TEW) den geeignetsten POM-Archetyp für die Proteinkristallisation darstellt, da TEW die Kristallisationen zweier vorher unbekannter Proteine, die Polyphenoloxidase aus Champignons (abPPO4) und die Auronsynthase aus Coreopsis grandiflora (cgAUS1) ermöglichte und zur Kristallisation des Standardproteins Hühnereiweiß-Lysozym in einer neuen Kristallform und zu einer neuen Kristallpackung in der Kristallstruktur der Nukleotidbindedomäne von HSP70 führte. TEW ist ein mächtiges Kristallisationsadditiv, welches große Vorteile gegenüber üblichen, verwendeten Additiven mit sich bringt. Durch seine sechs-fach negative Ladung bindet TEW an positiv geladene Proteinstellen aber auch an polare und ungeladene Regionen. Auf diese Weise wirkt TEW wie ein anorganischer Kleber, da es überwiegend gleich(positiv)-geladene Proteinregionen miteinander verbindet und somit die Ausbildung des Kristallgitters erleichtert. Unter den meisten Kristallisationsbedingungen ist TEW stabil und leistet durch das Freisetzen einer großen Anzahl von Wassermolekülen während der Ausbildung von Kristallkontakten einen enormen entropischen Beitrag zur Kristallisationsenergie, was wiederum die Kristallisation energetisch begünstigt. Desweiteren liefert es wertvolle anomale Signale, die für das Phasing von Proteinen, die kein passendes Homolog für das Molecular Replacement Verfahren besitzen, notwendig sind. All diese Eigenschaften und Ergebnisse sorgen dafür, dass TEW erfolgreich auf dem Markt etabliert wurde, indem es nun als Teil eines Kristallisations-Screens (Jena Biosciences) für alle Kristallographen käuflich zugänglich ist.