Analyse von Punktmutationen des org. Kationentransporters

Monoaminerge Neurotransmitter wirken an ihren entsprechenden Rezeptoren und vermitteln dadurch synaptische Informationsübertragung. Zwei Typen von Neurotransmitter-Transportern tragen aktiv zur Beendigung von synaptischer Informationsübertragung bei, indem sie Neurotransmitter aus der Synapse entfernen: dies sind die i) "Uptake-1"-Transporter (gekennzeichnet durch hohe Affinität aber niedrige Transportkapazität) und die ii) "Uptake-2"-Transporter (gekennzeichnet durch niedrige Affinität aber hohe Kapazität), und zu letzteren gehört der polyspezifische organische Kationentransporter 3 (OCT3). Sechsundzwanzig Missense-Mutationen wurden in OCT3 (abgekürzt als OCT3-MUT) aus einer dänischen Kohorte von Patient:innen identifiziert, die an verschiedenen psychiatrischen Störungen leiden. Das Ziel des gegenständlichen Projektantrags ist es, die Struktur-Funktions-Beziehung in OCT3 auf atomarer Ebene zu untersuchen und die Auswirkungen der identifizierten Mutationen auf die OCT3- Funktion zu ermitteln. Unsere Forschungsstrategie versucht, OCT3-Wildtyp (OCT3-WT) und OCT3-MUT auf verschiedenen Ebenen zu vergleichen: (i) strukturellen Ansätzen und computergestützten Homologiemodellen zur Untersuchung der strukturellen Dynamik des Transports an validierten 3D-Modellen, (ii) In-vitro-Aktivität, um ein Verständnis für die funktionellen Konsequenzen der Missense-Mutationen auf molekularer Ebene zu entwickeln, und (iii) Expressionsniveaus und Oligomerisierungseigenschaften, um das Zusammenspiel zwischen Mutationen, Oligomerisierung, Menge der oberflächenexprimierten OCT3-WT/MUT und Funktion zu identifizieren. Experimentelle in vitro Ansätze werden biochemische Tracer-Flux-Experimente und verschiedene Mikroskopie-Methoden verwenden, um die Transporter-Expression in den Zellen und die Oligomerisierung auf der Zelloberfläche zu beurteilen. Wir werden mehrere Ansätze in einer iterativen Strategie kombinieren: Wir werden Homologiemodelle von OCT3-WT und OCT3-MUT erstellen und darauf umfangreiche Molekulardynamiksimulationen durchführen, um die strukturelle Dynamik und die funktionellen Konsequenzen der Mutationen zu bewerten. Die computergestützten Methoden werden experimentelle Datensätze integrieren, um ein experimentell verifiziertes OCT3-WT-Homologiemodell zu etablieren und krankheitsverursachende Mutationen auf molekularer Ebene zu verstehen. OCT3 ist ein essentieller, aber wenig untersuchter Transporter, der ein wichtiges klinisches Ziel für neurologische Erkrankungen werden könnte. Minimales Ergebnis dieses Antrags ist eine funktionelle Charakterisierung von OCT3-WT und OCT3-MUT, wie sie für "uptake-1"-Transporter durchgeführt wurde. Die Vision ist es, eine umfassende Struktur-Funktions-Beziehung zu etablieren, die auf der Kenntnis der OCT3-WT-Transportfunktion und Oligomerisierung auf atomarer Ebene basiert.

OCT3 verstehen: Entschlüsselung seiner Struktur und Funktion für zukünftige therapeutische Fortschritte Unser Projekt zielt darauf ab, ein Schlüsselprotein im menschlichen Körper, den Organischen Kationentransporter 3 (OCT3), besser zu verstehen. Dieser Transporter spielt eine entscheidende Rolle beim Transport wichtiger Moleküle - wie der Neurotransmitter Dopamin und Serotonin - durch die Zellmembranen. Diese Moleküle regulieren die Stimmung, die Kognition und verschiedene andere physiologische Funktionen. Ein detailliertes Verständnis der Funktionsweise von OCT3 könnte erhebliche Auswirkungen auf die Entwicklung neuer Therapien für psychische Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Arzneimittelwechselwirkungen haben. Wir haben erfolgreich stabile Zelllinien mit verschiedenen genetischen Varianten (Mutanten) von OCT3 hergestellt und getestet, wie gut sie bestimmte Substanzen transportieren. Einige mutierte Versionen des Transporters zeigten keine Aktivität, während andere im Vergleich zum normalen (Wildtyp) Transporter hyperaktiv waren. Mithilfe fortschrittlicher bildgebender Verfahren entdeckten wir, dass die hyperaktiven Transporter einfach nur in größeren Mengen auf der Zelloberfläche vorhanden waren, während andere Defekte bei der Verarbeitung innerhalb der Zelle aufwiesen. Um herauszufinden, ob diese Defekte korrigiert werden können, wollen wir ein bekanntes Medikament, 4-Phenylbutyrat, testen, das erfolgreich zur Behandlung anderer Krankheiten eingesetzt wird, die durch ähnliche Probleme bei der Proteinfaltung verursacht werden. Ein wichtiger Meilenstein unseres Projekts war die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von OCT3 mithilfe einer fortschrittlichen Bildgebungsmethode, der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM). In Zusammenarbeit mit einem internationalen Forscherteam gelang es uns, die Struktur von OCT3 in drei verschiedenen Zuständen zu bestimmen: ungebunden (apo), gebunden an den Inhibitor Decynium-22 und gebunden an das Hormon Corticosteron. Dies war ein Durchbruch, da es das erste hochaufgelöste Modell von OCT3 überhaupt darstellt und die Grundlage für zukünftige Studien bildet. Auf der Grundlage dieser Strukturinformationen untersuchten wir mit Hilfe hochentwickelter Computersimulationen, wie OCT3 mit seinen natürlichen Substraten, Dopamin und Serotonin, sowie mit verschiedenen Inhibitoren interagiert. Durch umfangreiche Molekulardynamiksimulationen konnten wir wichtige Unterschiede in der Wechselwirkung dieser Moleküle mit bestimmten Regionen des Proteins aufdecken. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass OCT3 nur dann richtig funktionieren kann, wenn bestimmte molekulare Wechselwirkungen stattfinden - Wechselwirkungen, die durch Hemmstoffe offenbar gestört werden. Wir erweitern nun unsere Simulationen, um zu beobachten, wie OCT3 im Laufe der Zeit strukturelle Veränderungen erfährt, und um neue Moleküle zu identifizieren, die seine Funktion regulieren könnten. Diese Erkenntnisse könnten zur Entwicklung von Medikamenten führen, die die OCT3-Aktivität entweder verstärken oder blockieren, was einen therapeutischen Nutzen für neurologische und kardiovaskuläre Erkrankungen haben könnte. Durch die Kombination von Laborexperimenten, fortschrittlicher Bildgebung und Computermodellierung bringt uns unser Projekt dem Verständnis von OCT3 auf einem noch nie dagewesenen Niveau näher. Dieses Wissen könnte den Weg für zukünftige medizinische Durchbrüche ebnen und die Behandlung von Krankheiten verbessern, bei denen OCT3 eine entscheidende Rolle spielt.