Membrane glucocorticoid receptors

Ziel der Studie ist eine funktionelle Charakterisierung des membrangebundenen Glucocorticoid Rezeptors (mGR) und Vorarbeiten für die Etablierung eines klinischen Tests für Glucocorticoid Sensitivität. Glucocorticoide (wie Cortisol) sind lebensnotwendige Hormone, die Substratmetabolismus, Immun- und Stressreaktionen beeinflussen, aber auch als potente entzündungshemmende und immunsupprimierende Medikamente eingesetzt werden. Glucocorticoid Rezeptoren finden sich im Cytoplasma praktisch jeder Zelle des menschlichen Körpers; sie agieren durch Bindung an die DNA im Zellkern und beeinflussen so die Proteinsynthese. Abgesehen von diesem gut charakterisierten intrazellulären Rezeptor ("iGR") wirken Glucocorticoide - und andere Steroide - auch über einen angenommenen Membranrezeptor ("mGR"). Ein wichtiges und gut dokumentiertes Beispiel für einen solchen "nichtgenomischen" (von der DNA unabhängigen) Effekt ist der schnelle feedback Mechanismus, in dem Cortisol die Freisetzung seines übergeordneten Hormons ACTH (Corticotropin) aus der Hirnanhangsdrüse hemmt. Dieser Effekt wird in dem vorliegenden Projekt untersucht. Das größte Problem bei der näheren Charakterisierung ist die anscheinend niedrige Konzentration des Rezeptors auf der Zelloberfläche; teilweise widersprüchliche Ergebnisse wurden über die involvierten second messenger Systeme publiziert. Aus diesem Grund wird das Problem im vorliegenden Projekt mit Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), einer hochsensitiven Methode, die erst seit kurzem für die Biowissenschaften zur Verfügung steht, untersucht. FCS misst Diffusionsbewegungen von Fluoreszenz-markierten Molekülen in einem scharf fokussierten Laserstrahl (Messvolumen ca. 1 Femtoliter) und erlaubt die Untersuchung von Hormon-Rezeptor Interaktionen auf der Zellmembran einer einzelnen lebenden Zelle. Studiert werden Rezeptorkinetik, second messenger und der Einfluss von Veränderungen der Umgebungsparameter. Diese Untersuchungen werden kombiniert mit Standardverfahren (Northern Blot, FACS Analyse) zur weiteren Charakterisierung. Sie werden an einer Mäuse-Zelllinie (AtT-20), einem gut etablierten Modell für ACTH-produzierende Zellen, durchgeführt. Wegen der wahrscheinlichen Relevanz des mGR in PatientInnen, die gegenüber einer Glucocorticoid-Therapie resistent sind bzw. werden (dieser Zustand betrifft beispielsweise 5% der Asthmakranken) sollen FCS-Messungen auch an menschlichen Blutzellen (Monozyten, Lymphozyten) durchgeführt werden, um einen klinischen Test für Glucocorticoidsensitivität zu entwickeln.

In this project we demonstrated and characterized a membrane-associated glucocorticoid receptor using the highly- sensitive method of Fluorescence Correlation Spectroscopy. This new method allows for measurements in single, living cells. Starting point was the fact that not all known effects of cortisol and other glucocorticoids are explained through the known receptors inside the cell - some effects start too quickly or at concentrations which are much higher than the saturation concentrations of the known receptors. The receptor demonstrated in this study mediates the rapid effects of glucocorticoids, which are to be considered in the physiology (e.g. feed-back regulation of other hormones) as well as in pharmacology (e.g. in the therapy of allergic reactions). The binding of fluorescence- labelled dexamethasone (a powerful synthetic glucocorticoid hormone) at the membrane was measured in single cells of an ACTH-producing pituitary cell line, AtT-20. We could demonstrate that the binding was specific for glucocorticoids and not for related steroid hormones like estradiol or progesterone. Moreover, the characteristics of binding were different to those of the intracellular receptor (e.g. smaller sensitivity, positive cooperativity). The receptor seems to be coupled to a G protein and linked to the cytoskeleton. Interestingly, no binding could be demonstrated on peripheral blood momonuclear cells. Ongoing experiments are aiming to identify the receptor.