Membrangebundene Glucocorticoid-Rezeptoren

Ziel der Studie ist eine funktionelle Charakterisierung des membrangebundenen Glucocorticoid Rezeptors (mGR) und Vorarbeiten für die Etablierung eines klinischen Tests für Glucocorticoid Sensitivität. Glucocorticoide (wie Cortisol) sind lebensnotwendige Hormone, die Substratmetabolismus, Immun- und Stressreaktionen beeinflussen, aber auch als potente entzündungshemmende und immunsupprimierende Medikamente eingesetzt werden. Glucocorticoid Rezeptoren finden sich im Cytoplasma praktisch jeder Zelle des menschlichen Körpers; sie agieren durch Bindung an die DNA im Zellkern und beeinflussen so die Proteinsynthese. Abgesehen von diesem gut charakterisierten intrazellulären Rezeptor ("iGR") wirken Glucocorticoide - und andere Steroide - auch über einen angenommenen Membranrezeptor ("mGR"). Ein wichtiges und gut dokumentiertes Beispiel für einen solchen "nichtgenomischen" (von der DNA unabhängigen) Effekt ist der schnelle feedback Mechanismus, in dem Cortisol die Freisetzung seines übergeordneten Hormons ACTH (Corticotropin) aus der Hirnanhangsdrüse hemmt. Dieser Effekt wird in dem vorliegenden Projekt untersucht. Das größte Problem bei der näheren Charakterisierung ist die anscheinend niedrige Konzentration des Rezeptors auf der Zelloberfläche; teilweise widersprüchliche Ergebnisse wurden über die involvierten second messenger Systeme publiziert. Aus diesem Grund wird das Problem im vorliegenden Projekt mit Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), einer hochsensitiven Methode, die erst seit kurzem für die Biowissenschaften zur Verfügung steht, untersucht. FCS misst Diffusionsbewegungen von Fluoreszenz-markierten Molekülen in einem scharf fokussierten Laserstrahl (Messvolumen ca. 1 Femtoliter) und erlaubt die Untersuchung von Hormon-Rezeptor Interaktionen auf der Zellmembran einer einzelnen lebenden Zelle. Studiert werden Rezeptorkinetik, second messenger und der Einfluss von Veränderungen der Umgebungsparameter. Diese Untersuchungen werden kombiniert mit Standardverfahren (Northern Blot, FACS Analyse) zur weiteren Charakterisierung. Sie werden an einer Mäuse-Zelllinie (AtT-20), einem gut etablierten Modell für ACTH-produzierende Zellen, durchgeführt. Wegen der wahrscheinlichen Relevanz des mGR in PatientInnen, die gegenüber einer Glucocorticoid-Therapie resistent sind bzw. werden (dieser Zustand betrifft beispielsweise 5% der Asthmakranken) sollen FCS-Messungen auch an menschlichen Blutzellen (Monozyten, Lymphozyten) durchgeführt werden, um einen klinischen Test für Glucocorticoidsensitivität zu entwickeln.

In diesem Projekt konnte mit Hilfe der hochsensitiven Messtechnik Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) ein membrangebundener Rezeptor für Glucocorticoide gezeigt und charakterisiert werden. Diese neue Technologie erlaubt Messungen an einzelnen, lebenden Zellen. Ausgangspunkt der Studien war die Tatsache, dass nicht alle Effekte von Cortisol und anderen Glucocorticoiden durch die bekannten Rezeptoren im Inneren der Zelle erklärbar sind - manche Effekte treten zu rasch ein und werden erst bei Konzentrationen wirksam, die weit über der Sättigungskonzentration für die bekannten Rezeptoren liegen. Der in diesem Projekt gefundene Rezeptor würde als Mediator dieser raschen Glucocorticoid-Effekte, zu denen sowohl physiologische Mechanismen wie die feedback- Regulierung der Ausschüttung übergeordneter Hormone als auch pharmakologische Wirkungen z. B. im Rahmen der Asthma bronchiale Therapie gehören, in Frage kommen. An einzelnen Zellen einer ACTH-produzierenden Hypophysenzelllinie von der Maus (AtT-20) wurde die Bindung von Fluoreszenz-markiertem Dexamethason (einem starken synthetischen Glucocorticoid) an der Membran gemessen. Es konnte gezeigt werden dass die Bindung spezifisch für Glucocorticoide (und nicht verwandte Hormone wie Östradiol oder Progesteron) ist, die Bindungseigenschaften anders als beim intrazellulären Rezeptor sind (geringere Sensitivität, positiv kooperative Bindung), der Rezeptor (wie für viele Membranrezeptoren typisch) an ein G Protein gekoppelt und der Rezeptor mit dem Zellskelett verbunden zu sein scheint. Obwohl auch auf weißen Blutkörperchen schnelle Glucocorticoid-Effekte beschrieben sind, konnte auf diesen Zellen keine spezifische Bindung nachgewiesen werden. Ein weiterer Teil des Projektes befasste sich mit der Suche nach der Identität des Rezeptors; diese Versuche sind noch nicht abgeschlossen.