Hybride in situ Strukturanalyse von Actin mittels cryo-EM

Die Migration von Zellen ist ein grundlegender Bestandteil des Lebens. Organismen sind darauf angewiesen, dass sich ihre Zellen bewegen können, zum Beispiel während der Entwicklung eines Fötus oder wenn das Immunsystem sich gegen Eindringlinge schützen muss. Wie sind Zellen in der Lage, sich so effektiv zu bewegen? Die Antwort ist, dass sie ein ausgeklügeltes System von krafterzeugenden biologischen Maschinen entwickelt haben. Am vorderen Rand einer wandernden Zelle befindet sich ein dichtes Netz von Proteinfilamenten, Aktin genannt, die kontinuierlich nach außen drücken, so dass die Zellform tentakelartige Ausstülpungen und eine abgeflachte Haftlippe entwickelt, die die Zelle nach vorne zieht. Da die Zellbewegung ein so entscheidender Aspekt des Lebens ist, wird diese biologische Maschinerie sehr streng reguliert, und eine Möglichkeit, dies zu erreichen, besteht darin, zusätzliche Proteine zu produzieren, die das Netzwerk nach Bedarf verändern und lenken können. Obwohl wir wissen, dass dies geschieht, haben wir viele dieser Interaktionen nie direkt und mit ausreichender Genauigkeit beobachtet, um genau zu verstehen, wie diese Proteine ihre Wirkung entfalten. Dies hat ein vollständiges Verständnis der Zellmigration verhindert und Versuche verhindert, diese Maschinerie für eine medikamentöse Behandlung in Fällen zu nutzen, in denen die Motilität gestört ist, wie z. B. bei bösartigen Metastasen. Ziel dieser Forschung ist es, zum ersten Mal Schlüsselproteine, die die Migrationsmaschinerie steuern, mit nahezu atomarer Auflösung sichtbar zu machen. Dies geschieht direkt am vorderen Rand einer wandernden Zelle, die zur Erhaltung von Details tiefgefroren wurde. Unser Hauptwerkzeug dafür ist ein Elektronenmikroskop, das mit 300 Kilovolt arbeitet und im Idealfall in der Lage ist, einzelne Atome direkt sichtbar zu machen. Dies ist jedoch kein idealer Fall, da wir versuchen werden, in den vorderen Rand einer wandernden Zelle zu schauen. Da es sich hier um eine Umgebung mit dicht gepacktem Aktin und Bewegungsmaschinerie handelt, wird es eine Herausforderung sein, hineinzuschauen, um viele Details zu sehen. Daher müssen wir auch neue Methoden zur Verwendung des Mikroskops entwickeln und umsetzen, die es uns ermöglichen, das Innere der Zellen in erstaunlichen Details zu betrachten. Unser Ansatz basiert auf einer Methode, die Tomographie genannt wird, ähnlich wie ein CT-Scan bei einer Person, bei der die Zelle während der Aufnahme gedreht wird, um eine 3D-Ansicht des Zellinneren zu erzeugen. Durch die Nutzung dieser 3D-Informationen können wir das dichte Filamentnetzwerk entwirren und die Positionen der Schlüsselproteine, die uns interessieren, identifizieren. Um unsere Suche in dem dichten Netzwerk einzugrenzen, haben wir bereits eine Software entwickelt, mit der wir die Gesamtgeometrie und die Muster innerhalb des Filamentnetzwerks analysieren können, so dass wir uns auf Bereiche konzentrieren können, in denen wir die gesuchten Proteine vermuten. Sobald wir wissen, wo wir suchen müssen, können wir das Mikroskop auf konventionelle Weise einsetzen, um ultrahochauflösende Bilder unseres Zielmoleküls zu machen. Diese Arbeit wird die ersten hochdetaillierten Bilder wichtiger Proteine liefern, die die Aktin-vermittelte Zellmotilität steuern, und gleichzeitig neue elektronenmikroskopische Methoden für den Blick in Zellen entwickeln, die von anderen Labors auf der ganzen Welt übernommen werden können.

Die Zellmigration ist für die Entwicklung, Immunität und Gewebeerhaltung von entscheidender Bedeutung. Sie wird durch dichte Netzwerke von Aktinfilamenten an der Vorderkante der Zellen angetrieben, die hervorstehende und adhäsive Kräfte erzeugen, die die Zelle vorwärts bewegen. Dieser Mechanismus wird durch Aktin-bindende Proteine streng reguliert, doch viele ihrer Wechselwirkungen konnten bisher nicht direkt mit hoher Auflösung in überfüllten Umgebungen visualisiert werden, was unser Verständnis der Zellmotilität in Gesundheit und Krankheit einschränkt. Das ursprüngliche Ziel dieses Projekts war die Entwicklung und Anwendung von Kryo-Elektronenmikroskopie- und Kryo-Elektronentomographie-Methoden, einschließlich cryoSPARTAN, um den Aktin-basierten Motilitätsmechanismus in nahezu nativem Zustand sichtbar zu machen. Die Tomographie liefert dreidimensionale Ansichten von dichten Aktin-Netzwerken, wodurch die Filamentorganisation aufgelöst und potenzielle regulatorische Proteine identifiziert werden können, unterstützt durch die computergestützte Analyse der Netzwerkgeometrie . Parallel dazu trug diese Arbeit zu einer veröffentlichten Studie über das Huntington-Protein Huntingtin (HTT) bei. Wir konnten zeigen, dass HTT direkt an Aktinfilamente bindet und diese zu Bündeln zusammenfasst, wodurch sie zu dicht gepackten Anordnungen organisiert werden, ähnlich denen, die an der Vorderkante migrierender Zellen zu finden sind. Mithilfe von gereinigten Proteinaggregaten und Kryo-EM-Tomographie konnten wir die Wechselwirkungen zwischen HTT und Aktin innerhalb dicht gepackter Filamentnetzwerke sichtbar machen. Insgesamt treibt diese Arbeit die Kryo-EM-Methodik zur Untersuchung dichter Zytoskelettsysteme voran und liefert neue strukturelle Erkenntnisse über die Aktinregulation, einschließlich der Rolle von Huntingtin in der normalen Biologie und bei Krankheiten. Huntingtin (HTT). Wir haben gezeigt, dass HTT direkt an Aktinfilamente bindet und diese bündelt, wodurch sie zu dicht gepackten Anordnungen organisiert werden, ähnlich denen, die an der Vorderkante von migrierenden Zellen zu finden sind. Mithilfe von gereinigten Proteinaggregaten und Kryo-EM-Tomographie haben wir HTT-Aktin-Wechselwirkungen innerhalb dicht gepackter Filamentnetzwerke sichtbar gemacht. Insgesamt treibt diese Arbeit die Kryo-EM-Methodik zur Untersuchung dichter Zytoskelettsysteme voran und liefert neue strukturelle Erkenntnisse zur Aktinregulation, einschließlich der Rolle von Huntingtin in der normalen Biologie und bei Erkrankungen.