Wasseranalyse und Reinigungstechniken basierend auf Plantibodies

Während die Verwendung von gentechnisch veränderten Pflanzen für die Bioremediation, d.h. die insitu Reinigung kontaminierter Standorte, schon länger bekannt ist, wurde der Produktion von Antikörpern in Pflanzen und deren ex vivo Anwendung zur selektiven Abreicherung bisher kaum Beachtung geschenkt. Daher sollen im Forschungsvorhaben hoch affine und spezifische Antikörper (Plantibodies) gegen Algentoxine am Beispiel der Microcystine kostengünstig in Pflanzen produziert werden. Die Basis bildet ein in einem früheren Forschungsprojekt generierter monoklonaler Antikörper (Mab 10E7, Spezies: Maus). Nach dessen Sequenzierung soll eine für Pflanzen optimierte Sequenz der variablen Domänen synthetisch hergestellt und diese in geeignete Vektoren, die bereits die konstanten Antikörpersequenzen enthalten, zur stabilen Pflanzentransformation subkloniert werden. Zusätzlich soll ein scFv Fragment mit unterschiedlichen Tag-sequenzen und Fusionsproteinen konstruiert werden. Es kommen sowohl Blatt-basierte (Tabak) als auch Samen-basierte (Gerste) Systeme zum Einsatz. Die affinitätsgereinigten Plantibodies werden mittels Mikrotiterplatten-ELISA und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) bezüglich ihrer Bindungseigenschaften detailliert charakterisiert. Als Referenz dient der monoklonale Maus- Antikörper. Im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit für die spätere Anwendung sollen für das Upscaling zudem auch nur grob aufgereinigte Fraktionen (sequentielle pH- und Temperaturbehandlung mit anschließender Filtration) getestet werden. Nach erfolgter Immobilisierung der Plantibodies bzw. der Partikelfraktion auf geeigneten Trägermaterialien, z.B. Membranen, porösen Polymer-Monolithen bzw. in porösen Gläsern, wird deren Einsatz für die Abreicherung definiert mit Microcystinen gespikter Modellwasserproben geprüft.

Während die Verwendung von gentechnisch veränderten Pflanzen für die Bioremediation, d.h. die in situ Reinigung kontaminierter Standorte, schon länger bekannt ist, wurde der Produktion von Antikörpern in Pflanzen und deren ex vivo Anwendung zur sensitiven Detektion oder selektiven Abreicherung bisher kaum Beachtung geschenkt. Daher wurden in diesem Forschungsvorhaben hoch affine und spezifische Antikörper gegen Algentoxine am Beispiel der Microcystine in Pflanzen produziert. Die Basis dafür war ein in einem früheren Forschungsprojekt generierter monoklonaler Antikörper (Mab 10E7), der mit sehr hoher Sensitivität und Spezifität an [Arg4]-microcystine bindet und für die Detektion von Microcystin-Kontaminationen in Wasser und Nahrungsmittelproben optimal geeignet ist. Allerdings sind für die Entwicklung von diversen Schnelltests für den Endverbraucher oder von großflächigen Filtern für die Abreicherung große Mengen des sensitiven Antikörpers essentiell. Die ursprüngliche Version von MC10E7 war jedoch nur als Hybridomaklon erhältlich. Deshalb bestimmten wir in diesem Projekt die Sequenzen der variablen Regionen unter Abgleichung mit Peptidsequenzfragmenten und produzierten den Antikörper rekombinant in Hefe und Pflanzen (Nicotiana tabacum and N. benthamiana). Diese Systeme sind stabiler und wirtschaftlich attraktiver als Hybridomakulturen. Die affinitätsgereinigten Antikörper wurden mittels Mikrotiterplatten-ELISA und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) bezüglich ihrer Bindungseigenschaften detailliert charakterisiert, wobei der monoklonale Maus-Antikörper als Referenz diente. Durch Immobilisierung der pflanzen-produzierten Antikörper auf geeigneten Trägermaterialien, z.B. porösen Polymer-Monolithen, können sie zur Abreicherung eingesetzt werden. Ausserdem wurde ein auf Immun-detektion basierender Dipstick-assay mit dem in Pflanzen produzierten Antikörper entwickelt, der sehr hohe Sensitivität aufweist und zur Wasseranalyse vor Ort eingesetzt werden kann. Die exzellente Funktion und günstigere Produktion des Antikörpers mit Hilfe von Pflanzen, öffnet die Möglichkeit, diesen Antikörper für analytische und für Reinigungszwecke einzusetzen.