Spleißtherapien für Dystrophe Epidermolysis Bullosa (SpliceEB)

Die Rezessive Dystrophe Epidermolysis Bullosa (RDEB) ist eine seltene und schwerwiegende Hautkrankheit für die es derzeit keine ursächliche Behandlung gibt. Aktuelle Behandlungsmethoden dieser genetischen Erkrankung konzentrieren sich derzeit vorwiegend auf Linderung und Verhütung der Symptome. Eine Gentherapie stellt einen vielversprechenden Ansatz für RDEB dar. Allerdings limitieren die Größe und die repetitive Sequenz des COL7A1 Transkriptes die Anwendung einer Standard ex vivo Gentherapie wie sie von Mavilio et al. bei der junktionalen Form der Epidermolysis Bullosa gezeigt wurde. Ziel dieses Projektes ist es daher, neue, sicherere, effiziente und langanhaltende ex vivo Gentherapie Ansätze für RDEB zu entwickeln. In dieser Studie werden wir den in unserem Labor entwickelten 3` trans-splicing Gentherapie-Ansatz zur Korrektur der COL7A1 prä-mRNA an Keratinozyten von Patienten austesten, die eine homozygote COL7A1 c6527insC Mutation tragen, welche sehr häufig in RDEB Patienten in Südeuropa vorkommt. Die Genkorrektur wird in vitro und in vivo analysiert. Das Hauptaugenmerk liegt auf der Beantwortung von molekularen Sicherheitsfragen (zB Interaktionen zwischen Transgen und Empfängergenom), sowie auf der anhaltenden Regeneration von genkorrigierter Haut in einem robusten humanisierten Mausmodell. Ein weiterer Punkt in diesem Antrag ist die Entwicklung einer COL7A1 humanisierten RDEB Maus, die zur Austestung unserer 5` und 3` trans-splicing Therapie geeignet ist. Im Rahmen dieses Projektantrages planen wir auch die 5` trans- splicing Methode für die Korrektur von Mutationen im murinen Col7a1 Gen zu validieren. Hierfür verwenden wir ein passendes hypomorphes EB Maus Modell. Das SpliceEB Konsortium wird von jungen Wissenschaftern aus den Bereichen der Haut-Gentherapie (Koordinatorin Dr. M. Pasmooij, University Medical Center Groningen, Niederlande; Dr. A. Nyström, Medizinisches Universitätszentrum Freiburg, Deutschland; Dr. E. Murauer, Universitätsklinik Salzburg, EB Haus, Salzburg, Österreich) sowie einer Spezialistin im Bereich Antisense-mediated exon (AON) skipping (Dr. A. Aartsma-Rus, Leiden University Medical Center, Leiden, Niederlande) gebildet.

In diesem Projekt haben wir neue Therapieansätze für die Behandlung der schweren genetischen Hautkrankheit Dystrophe Epidermolysis Bullosa (DEB) erfolgreich in Mausmodellen getestet. Ursache von DEB sind vererbte Veränderungen (= Mutationen) im Kollagen 7 Gen. Die von diesem Gen erzeugte Abschrift (= Transkript) produziert das Kollagen VII Protein, das bei gesunden Menschen für eine feste Verankerung von Ober- und Unterhaut sorgt. Bei DEB Betroffenen ist der Zusammenhalt der Hautschichten gestört, und deshalb bilden sich bei mechanischen Reizen die charakteristischen Blasen auf der Haut. Patienten mit schwerer DEB Form, die durch ein komplettes Fehlen des Kollagen VII Proteins und daher durch eine schwerwiegende Blasenbildung gekennzeichnet sind, entwickeln oft chronische Wunden. Neben starken Schmerzen bergen diese Wunden auch ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von aggressiven Hauttumoren. Daher besteht für diese Patienten ein dringender medizinischer Bedarf für die Entwicklung von kausalen Therapien. Im Zuge des Projektes Korrektur von Kollagen Typ VII mittels RNA trans-splicing haben wir die RNA trans-splicing Technologie verwendet, um gezielt das Kollagen 7 Transkript in den betroffenen Hautzellen zu reparieren. Infolge soll ein normal funktionierendes Kollagen VII Protein gebildet, und somit der Zusammenhalt der Hautschichten erreicht werden. Mithilfe eines speziell entwickelten Reparaturmoleküls, auch RNA trans-splicing Molekül (RTM) genannt, das in die Zellen eingebracht wird, wird spezifisch ein fehlerhafter Abschnitt des Kollagen 7 Transkripts durch einen gesunden ersetzt. In diesem Projekt haben wir ein humanes RTM entwickelt, das spezifisch einen fehlerhaften Kollagen 7 Abschnitt in DEB Patientenhautzellen austauscht, sowie ein murines RTM, um einen fehlerhaften Abschnitt im Kollagen 7 Transkript von DEB Mäusen zu korrigieren. Nach dem Einbringen des humanen RTMs in die Hautzellen konnten wir eine erfolgreiche Korrektur des Transkripts sowie die Bildung eines normal funktionierenden Proteins nachweisen. Anschließend generierten wir aus den korrigierten humanen Hautzellen Hautäquivalente und transplantierten diese auf immundefiziente Mäuse. 12 Wochen nach der Transplantation hatte sich normale humane Haut gebildet, die korrigiertes Kollagen VII Protein zwischen den Hautschichten aufwies, und dadurch eine Blasenbildung verhinderte. Um das murine RTM sicher und mit geringen Schmerzen direkt in die Haut von gesunden und DEB Mäusen einzubringen, verwendeten wir eine sogenannte Gene Gun. 7 Tage nach der Applikation konnten wir korrigiertes Kollagen VII Protein in der Haut der Mäuse zeigen, was beweist, dass das Kollagen 7 Transkript direkt in den Hautzellen repariert wurde. In dieser Studie haben wir präklinische Therapieansätze für die RNA trans-splicing Technologie entwickelt, welche nun für die Anwendung an DEB Patienten adaptiert werden können.