Prospektive Validierung von Biomarkern im Ewing Sarkom für personalisierte Therapie (PROVABES)

Das Ewing Sarkom ist für Onkologen eine große klinische Herausforderung, da etwa 40% aller Patienten mit den derzeit zur Verfügung stehenden multimodalen Therapien nicht geheilt werden können. Zwar wurden in retrospektiven Studien an kleinen Patientenkollektiven mehrere viel versprechende prognostische Merkmale beschrieben, doch wurde bisher nur der EWS-FLI1 Fusionstyp prospektiv und mit negativem Ergebnis validiert. Deshalb begründen wir das "PROspective VAlidation of Biomarkers in Ewing Sarcoma for personalised translational medicine" (PROVABES) Konsortium, um prospektiv die Vorhersagekraft bisher beschriebener Kandidaten Biomarker, allein oder in Kombination, für den Krankheitsverlauf zu überprüfen. Biomarker, die mit guter oder schlechter Prognose einhergehen, sind entweder selbst in die Pathogenese und/oder das therapeutische Ansprechen der Erkrankung involviert, oder dienen als Surrogate oder Produkte von für den Krankheitsverlauf essentiellen Signalwegen. Es ist zu erwarten, dass Treiber der Krankheitsprogression die höchste Stabilität als Biomarker aufweisen und sogar als potentielle therapeutische Angriffspunkte dienen können. Daher dient die funktionelle Charakterisierung von prognostisch relevanten Molekülen der prospektiven Validierung in Patienten, indem sie mechanistische Erklärungen für die klinisch beobachteten Korrelate bietet. Während für einige der in PROVABES untersuchten Moleküle (CXCR4, STEAP1, EZH2, PARP1) schon ausreichend präklinische funktionelle Daten existieren, gilt das nicht für die vermeintlichen Zielstrukturen von kürzlich beschriebenen Ewing Sarkom Prädispositionsloci (Postel-Vinay et al., 2012) (WP1.2), und die MicroRNA hsa-mir-34a (Nakatani et al., 2012) (WP 2). Als ein zusätzlicher Gewinn für das PROVABES Konsortium strebt WP4, ein exploratives PROVABES Arbeitspaket, nach der Definition relevanter molekularer Targets für diese epigenetischen (miRNA und SNP) Biomarker. In enger Zusammenarbeit mit unseren Partnern am Rizzoli Institut in Bologna (Katia Scotlandi/Piero Picci) für hsa-mir-34a, und am Institut Curie Paris (Franck Tirode/Olivier Delattre) für die Prädispositions-SNPs auf den Chromosomen 10 und 15, werden wir die funktionelle Relevanz von zuvor identifizierten Kandidaten Zielgenen untersuchen. Diese Kandidaten wurden auf Grund ihrer Nähe zu den Marker- SNPs (BMF and SIRT1), beziehungsweise basierend auf der physischen Interaktion ihrer mRNA Produkte mit die MicroRNA hsa-mir-34a enthaltenden RISC ausgewählt (TBL1XR1, XBP1, ARL6IP1, CAMK1D, TMEM189, RBMX). Wir werden eine in vitro funktionelle Analyse Pipeline aufbauen (Leistung D4.2), welche auf der differentiellen Expression der genannten Marker in vier Sets von gepaarten Ewing Sarkom Zelllinien von lokalisierten Tumoren und deren korrespondierenden Metastasen (Test Panel), und je 6 Zelllinien von unverwandten lokalisierten Tumoren und Metastasen (Validierungs Panel) basiert. Zuerst werden die Test Zelllinien mittels Affymetrix OncoScanTM (WP1.1) und Next Generation Sequencing der RNA (RNA-seq, WP1.2) bezüglich differentieller Genkopienzahl, Genexpression, und Sequenzvariationen zwischen den lokalisierten und korrespondierenden Metastasenzelllinien charakterisiert (Leistung D4.1). Die Resultate der Zelllinien werden dann mit jenen primärer Tumore aus dem Arbeitspaket WP1.2 verglichen. Exogene MicroRNA hsa-mir-34a beziehungsweise entsprechende anti-MicroRNA wird in ausgewählte Zelllinien des Validierungspanels eingebracht, um funktionell die Regulation der sechs ausgewählten vermuteten Zielgene auf Expressionsebene zu bestätigen. Nachfolgend werden wir die Auswirkungen der experimentellen Modulation aller Kandidatengene auf Zellwachstum unter adhärenten und nicht-adhärenten Bedingungen, Migration und Invasivität quantifizieren. Diese Parameter werden sowohl unter normoxischen als auch hypoxischen Wachstumsbedingungen wie von uns bereits beschrieben (Aryee et al., 2010) analysiert werden. Wir erwarten, dass diese in vitro funktionelle Validierung von vermutlichen Zielgenen der Chromosom 10 und 15 Prädispositions-SNPs (SIRT1, BMF; Leistung D4.3), und von hsa-mir-34a (TBL1XR1, XBP1, ARL6IP1, CAMK1D, TMEM189, RBMX; Leistung D4.4) die biologischen Mediatoren jener epigentischen Merkmale identifiziert, welche für die beobachteten unterschiedlichen klinischen Krankheitsverläufe verantwortlich sind.

Das Ewing Sarkom ist ein hoch maligner Knochentumor bei Kindern und Jugendlichen. Die Ursachen und Vorhersagekriterien für unterschiedlich aggressiven Krankheitsverlauf bei Patienten mit Ewing Sarkom sind weitgehend unbekannt. Die im ERA-NET Projekt PROspective VAlidierung von Biomarkern im Ewing Sarkom (PROVABES) zusammengeschlossenen Europäischen Arbeitsgruppen haben in der Vergangenheit auf Grund der retrospektiven Analyse kleiner Patientengruppen eine Reihe von Biomarkern beschrieben, denen eine prognostische Bedeutung nachgesagt wird. PROVABES sollte diese Kandidaten systematisch untersuchen und prospektiv validieren. Dieses FWF geförderte Subprojekt hatte zum Ziel, für einige ausgewählte Kandidaten, die funktionelle Grundlage für deren pathogene Aktivität in vitro zu definieren. Im Mittelpunkt stand die Untersuchung von im Ewing Sarkom deregulierten MicroRNAs und von DANN-Sequenzvariationen in drei chromosomalen Regionen, welche mit der Anfälligkeit für die Entwicklung eines Ewing Sarkoms korrelieren. Wir entwickelten eine Methode, um das gesamte Spektrum von Genen, die von MicroRNAs innerhalb eines Zelltyps reguliert werden, zu ermitteln und setzten sie zum Studium eines im Ewing Sarkom hoch-regulierten MicroRNA-Clusters (hsa-miR-17/92) ein. Wir konnten zeigen, dass etwa ein Viertel aller Zielgene dieser MicroRNA Familie eine Rolle in der Umschaltung zweier verwandter Signalübertragungswege spielen, welche die Stammzelleigenschaften der Tumorzellen regulieren. Auch fanden wir eine regulatorische Verbindung zwischen diesen Signalwegen und einem mit Ewing Sarkom Metastasen assoziiertem Gen (SIRT1), welches nahe eines der drei Ewing Sarkom Anfälligkeitsregionen kodiert wird. Das Genprodukt ist ein Enzym, welches NAD für seine Aktivität benötigt. Wir konnten zeigen, dass Ewing Sarkome besonders sensitiv auf die pharmakologische Inhibition der NAD Biosynthese reagieren, was potentiell einen neuen therapeutischen Weg eröffnet. Für die beiden anderen Krankheits-assoziierten Chromosomenregionen entdeckten wir, dass diese Gene beinhalten, die eine Rolle in der unmittelbaren Antwort auf zellulären Stress spielen. Diese Antwort erfolgt auf der Ebene der Proteinsyntheseregulation und beinhaltet die transiente Bildung zytoplasmatischer Körperchen. Wir fanden, dass die Unterdrückung dieser Gene zu einer Veränderung in der Dynamik dieser Stressantwort führt und das Oberflächen-unabhängige Tumorzellwachstum unterdrückt. Schließlich führten wir gemeinsam mit unseren PROVABES Partnern auch eine umfangreiche Epigenomanalyse an etwa 140 Patiententumoren durch und definierten drei Ebenen der Tumorheterogenität, die Rückschlüsse auf Diagnose, Phänotyp und Prognose der Patienten ermöglichten. Dieses Projekt resultierte somit in einer Reihe neuer Einsichten in die Biologie des Ewing Sarkoms und jener Mechanismen, die für die Aggressivität der Erkrankung verantwortlich sind.