E Protein Interaktionen im Fusionsprozess von Flaviviren

Flaviviren dringen über Endozytose und die Fusion der viralen mit der endosomalen Membran in Zellen ein. Hauptverantwortlich für diese essentiellen Prozesse ist das Oberflächenprotein E, ein Klasse II virales Fusionsprotein. Wichtige Details der Struktur des E-Proteins und seiner Rolle im Fusionsprozess sind bekannt, wie die Kristallstrukturen der E-Ektodomäne in seiner Prä- und Postfusionskonformation. Die Ektodomäne besteht aus drei Domänen (DI-III), die stäbchenartig in der Präfusionsform angeordnet sind, mit DI im Zentrum. DII besitzt ein Fusionspeptid an seinem distalen Ende. DIII ist über den sogenannten "Stamm" mit dem carboxyterminalen Membrananker verbunden. Niedrige pH-Werte, wie sie in Endosomen herrschen, bewirken eine Dissoziierung der E-Dimere in Monomere, durch die das Fusionspeptid exponiert wird und in die Zielmembran inserieren kann. Danach entstehen aus den Monomeren Trimere mit einer Haarnadel-ähnlichen Konformation, in welcher der Carboxyterminus von DIII in Richtung Fusionspeptid weist. Die aktuellen Fusionsmodelle postulieren wichtige Interaktionen des Stamms mit DII des Trimers, wodurch der Membrananker und das Fusionspeptid in enge Nachbarschaft gelangen. Bisher ist es jedoch noch nicht gelungen die Kristallstruktur der vollständigen E- Ektodomäne, die auch den Stamm in seiner Postfusionskonformation enthält, zu klären. Neueste mit dem E-Protein von Dengue Viren gewonnene Strukturdaten deuten darauf hin, dass der obere Teil des Stamms ungeordnet ist. Der Stamm der Klasse II Fusionsproteine von Togaviren ist wesentlich kürzer und Strukturdaten liefern Details der Interaktionen des Stamms mit DII. Zusätzlich hat der Stamm des EFF-1 Fusionsproteins von C. elegans ein strukturell dem Flavivirus E verwandtes Protein ungefähr die gleiche Anzahl an Aminosäuren wie das E-Protein. In der Postfusionsstruktur von EFF-1 ist (ebenso wie beim Dengue Virus E) der obere Teil des Stamms ungeordnet, während der untere Teil ähnliche Interaktionen mit DII eingeht wie dies bei Togaviren der Fall ist. Da die Interaktionen des Stamms die Energie zur Verfügung stellen, die für die Zusammenführung der Fusionspeptide und Membrananker und dadurch für die Fusion notwendig ist, könnte diese Region einen wichtigen Angriffspunkt für antivirale Medikamente darstellen. Im Rahmen dieses Projekts sollen daher strukturelle Details des Stamms geklärt werden, um neue Erkenntnisse über den Flavivirus Fusionsprozess zu gewinnen. Zu diesem Zweck werden wir zwei Strategien für die Produktion von rekombinanten E-Proteinen zur Kristallographie verfolgen und funktionelle Analysen durchführen. Die erste Strategie umfasst Deletionen des oberen Teils des Stamms, die auf den oben angeführten strukturellen Daten beruhen. Als zweite Strategie schlagen wir die Klärung der Struktur des E-Proteins von Flaviviren vor, die nur Insekten infizieren können. Der carboxyterminale Teil dieser Proteine scheint jenem der Togaviren zu entsprechen, mit einer wesentlich kürzeren Stammregion. Strukturelle Informationen über die Interaktionen des Stamms mit Domäne II wären ein großer Fortschritt im Verständnis des Fusionsmechanismus von Flaviviren und bilden die Voraussetzung für die Struktur-basierte Entwicklung von antiviralen Agentien, die gegen diese Region gerichtet sind.

Zu den Flaviviren zählen eine Reihe von wichtigen human-pathogenen Viren wie die Dengue-, Zika-, Gelbfieber-, West-Nil-, Japanische Enzephalitis- und Frühsommermeningoenzephalitis (FSME)-Viren. Da es sich um membranumhüllte Viren handelt, umfasst die Infektion von Wirtszellen einen Schritt, bei dem die Virusmembran mit einer Zellmembran verschmolzen wird. Dieser Fusionsprozess führt zur Freisetzung des viralen Genoms in die Zelle und zur Initiierung der Virusreplikation. Die Flavivirus-Fusion wird durch das Haupt-Hüllprotein E (ein virales Klasse-II-Fusionsprotein) gesteuert. Nach Wechselwirkungen mit bestimmten zellulären Faktoren, die als Trigger wirken, durchläuft das E-Protein dramatische strukturelle Änderungen, wodurch die Fusion der beiden Membranen vermittelt wird. In diesem Projekt haben wir neue Erkenntnisse zum Flavivirus-Fusionsprozess gewonnen, indem wir Interaktionen von verschiedenen Regionen des E-Proteins untersucht haben, die für die Umwandlung in den fusionsaktiven Zustand notwendig sind. Wir konnten neue atomare Details des E-Proteins des FSME-Virus klären und identifizierten wichtige Elemente, die an diesem entscheidenden Schritt im viralen Vermehrungszyklus beteiligt sind. Unsere Daten erweitern somit die bestehenden Modelle des Flavivirus-Fusionsprozesses und können den Weg für neue antivirale Strategien ebnen, die auf diese Regionen abzielen.