Mechanismen der Gerhirnfunktion bei geistiger Behinderung mit mTOR-Defizienz (mTOR-DIDS)

MID1 und alpha4 steuern den Ubiquitin-abhängigen Abbau der Proteinphosphatase 2A (PP2A), einem wichtigen Gegenspieler vieler Kinasen, wie z.B. mTOR, dem zentralen Regulator der Translation. Der MID1-Komplex ist ein mRNP und wandert PP2A-reguliert in Neuronen entlang der Mikrotubuli. Der mTOR Inhibitor Rapamycin dissoziiert den MID1 Komplex und ein Fehlen von MID1, wie bei Opitz BBB/G Syndrom (OS, Mittelliniendefekte wie Lippen/Kiefer/Gaumenspalte oder Hypospadien und leichte mentale Beeinträchtigung) führt zu einer Anhäufung von PP2A auf den Mikrotubuli. Diese erhöhten PP2A-Mengen behindern die Bildung eines aktiven mTOR Komplexes, was schließlich zu verminderter Translation führt. Zudem ist MID1 ein Sequenz-spezifischer Translations-Regulator, der die Synthese von PDPK1, einem übergeordnetem mTOR-Regulator, steuert. Andere Syndrome wie Rett-Syndrom (verursacht durch Mutationen in Cdkl5 und MeCP2), die wie OS ebenfalls zu geistiger Behinderung führen können, zeigen auch reduzierte mTOR Aktivität, wogegen Downs und Fragiles X Syndrom erhöhte mTOR Aktivität aufweisen. In Neuronen kontrolliert mTOR Zellgröße, Axon-Wegfindung und Regeneration, sowie Dendritenmorphologie höchstwahrscheinlich durch Regulation der lokalen Translation von spezifischen neuronalen Proteinen. Wir wollen daher das lokale Proteom und Transkriptom in den Synapsen von Cortex und Hippocampus von entsprechenden Maus-Modellen mit geistiger Behinderung (verfügbar durch die anderen Teams) studieren, die mit Veränderungen in mTOR einhergehen. Wir wollen Proteine identifizieren, deren lokale Translation mTOR-abhängig gesteuert ist und die mit geistiger Behinderung korrelieren. Dazu werden wir (i) mittels "Deep Sequencing" von synaptosomaler RNA aus Cortex und Hippocampus die Transkriptome der Maus-Modelle mit Kontrollen vergleichen, (ii) analoge Vergleiche mittels qualitative und quantitative Analysen der entsprechenden Proteome und Phosphoproteome unter Verwendung von TMT-basierter quantitativer Massenspektrometrie durchführen und (iii) werden die Rollen der identifizierten mTOR-regulierten Proteine bei synaptischer Plastizität, Lernen und Gedächtnis studieren (in enger Zusammenarbeit mit den andern Teams). Um die Proteome und Transkriptome der Synapsen zu entschlüsseln, werden wir Synaptosomen der entsprechenden Gehirnregionen isolieren, daraus die RNAs und Proteine extrahieren und mittels der zur Verfügung stehenden Omics-Plattformen in Berlin und Innsbruck analysieren. Dies sollte uns erlauben die mRNA-Spiegel mit den entsprechenden Protein-Mengen Syndrom-spezifisch zu korrelieren und dadurch Krankheits-relevante synaptosomale mTOR-Zielproteine zu identifizieren. Diese Kandidaten müssen dann durch unabhängige Methoden bestätigt werden und weiteren Analysen bezüglich ihrer Rolle bei Gehirnfunktionen unterzogen werden. Dies wird zu neuen Erkenntnissen für die Differentialdiagnose bei geistiger Behinderung führen und in Zukunft möglicherweise auch Wege eröffnen um neue therapeutische Strategien für Patienten mit geistiger Behinderung und verwandten Störungen zu entwickeln.

Veränderte Aktivitäten der Kinase mTOR wurden bereits mit den Ursachen für verminderte Intelligenz bei mehreren Erbkrankheiten des Menschen korreliert. In diesem Projekt wollten wir den Einfluß der Aktivität dieser Kinase auf das lokale Proteom und RNom in Synapsen studieren. Dazu bedienten wir uns zweier Mausmodelle, die solche Erbkrankheiten wiederspiegeln, um Einblick in die Mechanismen, die zu verminderter Intelligenz führen können, zu erlangen. Dabei wurden uns vom gemeinsamen europäischen Forschungskonsortium Gehirnproben von Mäusen mit Tuberöser Sklerose (TSC2-Mutation) und mit einer CDKL5-Defizienz (CD) zu Verfügung gestellt - beides Syndrome, die mit geistiger Behinderung einhergehen und durch erhöhte (TSC2) bzw erniedrigte (CD) mTOR- Aktivität gekennzeichnet sind. Nach der Etablierung einer gut reproduzierbaren Methode zur Isolierung von Proteinen und RNAs aus Synapsen und Cytosol ausgehend von gefrorenen Gehirnproben analysierten wir deren Zusammensetzung mit Hilfe von quantitativer Massenspektrometrie und Deep-sequencing von RNA. Unser Protokoll erlaubte die Identifizierung von 1200 Proteinen in den Synapsen aus TSC2-Mäusen, wobei sich viele in Ihrer Menge zwischen Mutante und Wildtyp signifikant unterschieden. Viele Unterschiede korrelierten mit bereits publizierten Daten, aber wir entdeckten auch Unterschiede in Proteinen, die bisher nicht mit TSC2 in Verbindung gebracht worden waren, speziell solche mit Funktionen in neuronaler Differenzierung und Transmission. Eine Gruppen-Analyse von Proteinen mit verminderten Spiegeln in der Mutante korrelierte diese mit Neurotransmitter- Metabolismus. Die gefundenen Unterschiede waren nicht sehr groß (bis zu 50%) dies ist allerdings nicht unerwartet, weil es sich um eine heterozygote Mutante handelt, das heißt, dass eines der TSC2 Gene noch intakt ist. Tatsächlich konnten wir sogar sehen, dass die Menge an TSC2-Protein selbst unverändert war, wahrscheinlich durch eine translationale Gegenregulation, denn die RNA war wie erwartet halbiert. Wenn die Mäuse zuvor allerdings Verhaltenstests inklusive sozialem Stress unterworfen wurden, zeigten sich deutlichere Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutante und zwar sowohl bei Protein- als auch bei RNA- Spiegeln. Es stellte sich heraus, dass die ungestressten Mutanten das gleiche Protein und RNA-Muster zeigten wie die gestressten Wildtypen. Dieses Ergebnis läßt vermuten, dass die Neuronen in den ungestressten Mutanten sich in einem konstant gestressten Zustand befinden und dass die Stressantwort im Kontext von überaktiviertem mTOR in den Mutanten signifikant verändert ist. Außerdem fanden wir große Alters-abhängige Unterschiede in den synaptosomalen Protein Spiegeln zwischen Mutante und Wildtyp. Dies passt sehr gut zu dem beim Menschen beobachteten progredienten Krankheitsverlauf. Diese Alters- Abhängigkeit führte leider auch zu einer Verzögerung im Projekt, weil die entsprechend lange Aufzucht und Behandlung der Mäuse viel länger als geplant dauerte. Die Unterschiede bei den CDKL5-defizienten Mäusen waren eher gering und es bedarf noch weiterer Analysen für konkrete Aussagen. Die Stress- und Alters-Abhängigkeit bei TSC2 wäre eine mögliche Erklärung für die große phenotypische Variabilität dieses Syndroms beim Menschen.