Struktur und Funktion der antifungalen Proteine PAFB und NFAP

Die rasante Zunahme von Pilzinfektionen und die rasche Entwicklung von Antimykotika-resistenten Schimmelpilzen, die schwere Mykosen auslösen können, Kulturpflanzen infizieren oder Kulturgüter zerstören und somit große medizinische Probleme und ökonomische Verluste verursachen, verlangen die Entwicklung neuer antifungaler Strategien. Die neuen antifungalen Proteine PAFB aus Penicillium chrysogenum und NFAP aus Neosartorya fischeri NRRL 181 zeigen großes Potenzial, um in diesen Anwendungsgebieten eingesetzt zu werden. Allerdings ist die Struktur, der Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion und der antifungale Mechanismus von PAFB und NFAP nicht im Detail untersucht worden. Im Zuge des beantragten Projekts sollen (1) die Struktur, Proteindynamik und der Faltungs-/Entfaltungsprozess von PAFB und NFAP aufgeklärt werden, (2) zentrale Proteinmotive identifiziert werden, die für die korrekte Faltung und die Interaktion der Proteine mit pilzlichen Zielmolekülen verantwortlich sind und (3) erste Schritte gesetzt werden, um potentielle pilzliche Zielmoleküle zu charakterisieren. Dazu planen wir PAFB und NFAP in pilzlichen Expressionssystemen rekombinant herzustellen, um sie dann mit Hilfe von hoch entwickelter und modernster NMR Technologie und funktionellen Analysen im Detail zu charakterisieren. Dieser Ansatz wird es uns erlauben, die spezifischen Eigenschaften von PAFB und NFAP mit denen von bereits bekannten und charakterisierten antifungalen Proteinen zu vergleichen und Rückschlüsse auf ähnliche oder unterschiedliche antifungale Wirkungsweisen zu schließen. Die bilaterale Kooperation zwischen dem Ungarischen und Österreichischen Expertenteam verspricht eine erfolgreiche Durchführung der geplanten Studie mit Hilfe eines interdisziplinären Ansatzes. Die gesammelten Daten werden einen bedeutenden Beitrag leisten zum Verständnis von Wirkungsmechanismen und der Struktur-abhängigen biologischen Funktion dieser neuen Gruppe antifungaler Proteine. Daraus kann die Entwicklung neuer antifungaler Strategien, das Design und die Patentregistrierung von neuen, wirkungsvollen, Ziel-gerichteten antifungalen Produkten mit geringen oder keinen Nebenwirkungen erwartet werden.

In den letzten Jahrzehnten ist die Zahl von Pilzinfektionen in Pflanzen, Tieren und im Menschen stark angestiegen. Derzeit stehen uns nur eine begrenzte Anzahl von zugelassenen Substanzen zur Behandlung dieser Infektionen zur Verfügung. Einige davon haben schweren Nebenwirkungen, weil Pilze als Eukaryonten in Zellstruktur und Physiologie dem Wirt sehr ähnlich sind. Des Weiteren entwickeln pathogene Pilze sehr rasch Resistenzen gegen vorhandene Antimykotika. Filamentöse Pilze (Schimmelpilze) sind eine reiche Quelle für kleine, positiv-geladene antimikrobielle Proteine (AMPs), die potentielle Kandidaten für die Entwicklung neuer Strategien in der Behandlung von Pilzinfektionen darstellen. Die genaue Kenntnis ihrer Struktur und Funktion ist dabei eine wichtige Voraussetzung, um das antifungale Potenzial dieser Biomoleküle zu nutzen oder sogar eine Potenzialsteigerung durch rationales Design zu erzielen. Das Ziel dieses Projektes war es, neue AMPs von Schimmelpilzen zu charakterisieren, das Verhältnis zwischen der Struktur und Funktion bereits beschriebener AMPs im Detail zu verstehen und das Potenzial für die Anwendbarkeit von AMPs zu beweisen. Dazu war die Herstellung großer Mengen von qualitativ hochwertigen AMPs notwendig. Um dieses Ziel zu erreichen, entwickelten wir ein Proteinexpressionssystem und verwendeten den AMP produzierenden Schimmelpilz Penicillium chyrsogenum als "AMP-Fabrik". Dieses System erlaubte es, saubere rekombinante AMPs aus dem Kulturüberstand zu gewinnen und AMP Varianten herzustellen, in denen an bestimmten Stellen Aminosäuren ausgetauscht wurden. Damit konnte die Auswirkung dieser Veränderungen auf die Proteinstruktur und -funktion untersucht werden. Es wurden die AMPs PAFB von P. chrysogenum, NFAP und NFAP2 von Neosartorya fischeri, AfpB von Penicillium digitatum und Varianten des P. chrysogenum Proteins PAF hergestellt. Analysen der Proteinstruktur mittels Kernspinmagnetresonanz (NMR) ergaben, dass alle analysierten AMPs eine charakteristische und sehr stabile 3D Struktur aufweisen, ähnlich der bereits bekannten PAF Struktur. Für die Ausprägung der vollen antifungalen Aktivität ist die richtige Verteilung der positiven Ladung auf der Proteinoberfläche wichtig, da sie die Interaktion mit der negativ geladenen Plasmamembran der Pilzzellen ermöglicht. Weiters wurde AfpB aus P. digitatum strukturell und funktionell charakterisiert, und es konnten Strukturmotive identifiziert werden, die für die Aktivität und Spezifität dieses AMPs eine wichtige Rolle spielen. Schließlich konnten wir zeigen, dass die Anwendung von NFAP2 eine vulvovaginale Infektion durch den humanpathogenen Pilz Candida albicans im Mausmodell erfolgreich verhindern kann. Auf der Suche nach möglichen AMP-Interaktionspartnern untersuchten wir im Speziellen die Lipidzusammensetzung der Zellmembranen und deren Rolle in der Sensitivität des Modellpilzes Neurospora crassa gegenüber den unterschiedlich wirkenden AMPs PAF und PAFB. Die Ergebnisse dieses Projekts tragen wesentlich zum Verständnis von Struktur und Funktion von AMPs bei - eine wichtige Voraussetzung zur Entwicklung von Medikamente mit neuen Wirkungsmechanismen. Aus diesem Grund sind unsere Ergebnisse für eine zukünftige Anwendung von antifungalen Proteinen aus Schimmelpilzen in der Landwirtschaft und in der Medizin von überaus wichtiger sozial-ökonomischer Bedeutung.